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    PacBio测序即单分子实时测序，其以SMRT Cell为载体进行测序反应，位于ZMW孔底部的荧光信号检测区锚定了DNA聚合酶和一条DNA片段，并通过不同荧光标记的核苷酸及荧光激发的过程，将不同碱基的信号捕捉下来，从而得到DNA序列信息。

                SMRT cell                                            ZMWs                                              荧光基团

PacBio Sequel IIe

    与传统的二代测序技术相比，三代PacBio测序技术具有超长读长、无需扩增、无GC偏好性、可以直接检测碱基修饰等优点，在科研与医学相关领域得到广泛应用。PacBio最新推出的Sequel II（Sequel IIe）测序平台共有两种测序模式，即CLR测序和HiFi测序。

    CLR测序模式称为超长测序模式，其插入片段长度在30Kb以上，产生的数据是基于单循环测序的结果，一个插入片段只测序一次，准确率和PacBio 常规测序保持一致，在85%左右。CLR测序可以利用自身的数据进行纠错，当数据深度达到 50X 左右时，一致性序列准确性超过99.999%（QV50）。

CLR 测序示意图

    通过构建40Kb文库，菲沙PacBio Sequel II平台CLR测序最高产出达到220Gb，平均150Gb；Subreads 平均读长20Kb，N50平均超过29Kb，具体见下表。

CLR下机数据统计表

    PacBio HiFi Reads是准确度超过Q20（>99%），并且还能兼顾超过10kb，甚至可达20 kb的长读长测序模式。在HiFi测序模式下，酶读长与CLR测序模式相当甚至更长（超过100 Kb），但插入片段只有10-20 Kb，因此测序时酶会绕着DNA模板（插入片段）进行滚环测序，即插入片段会被多次测序。这样单次测序中造成的随机测序错误，可以通过算法进行自我纠错校正，最终得到高准确度的HiFi Reads。

HiFi测序示意图

    通过构建15-20Kb的文库，菲沙PacBio Sequel II平台HiFi测序CCS原始数据超过500Gb，平均产出380Gb；HiFi最高产出38Gb，平均接近19Gb；HiFi平均读长15Kb，N50接近17Kb，具体见下表。

HiFi下机数据统计表