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在获得机构审查委员会批准后，研究者回顾性地确定了从2017年1月至2020年12月进行外周血 NGS 的患者，共2403名。其中，368名患者接受了骨髓标本的NGS评估。研究者随后排除了骨髓和外周血NGS间隔时间超过1年的患者，将研究人群缩小至351人。通过审查患者的医疗记录以确定诊断、治疗史和骨髓活检结果，并排除接受化疗或骨髓移植的患者，其中包括接受化疗的162名患者和接受骨髓移植的26名患者，最终将研究人群缩小至163人。

研究者记录了上述163名患者NGS检测的结果，并保证检测所使用的是相同的panel。案例为方便进行统计被分类为完全一致、部分一致和不一致。

完全一致：被定义为骨髓和外周血 NGS 显示一组相同的异常基因或基因的情况。

部分一致：被定义为骨髓和外周血两种模式识别出一些异常基因相同但不是所有相同的情况。

不 一 致：被定义为在骨髓和外周血中检测到的基因之间没有重叠的情况，要么是由于在两种模式中检测到完全不同的基因，要么是在一种模式中检测到异常基因但在另一种模式中没有检测到。

备注：通过kappa系数评估外周血和骨髓NGS的一致性。kappa系数(κ)值表示基于Altman(1991)[7]的一致性强度，如下所示：

差        κ≤ 0.20，

一般     κ= 0.21-0.40，

中度     κ= 0.41-0.60，

良好     κ= 0.61-0.80，

非常好  κ= 0.81–1.00。

研究对象进行NGS检测使用的是Illumina TruSight sequencing panel。其中血液恶性肿瘤panel共包含54个基因，涵盖与血液恶性肿瘤报告相关的最具临床意义的突变。这些基因包括：

ABL1、ASXL1、ATRX、BCOR、BCORL1、BRAF、CALR、CBL、CBLB、CBLC、CDKN2A、CEBPA、CSF3R、CUX1、DNMT3A、ETV6、EZH2、FBXW7、FLT3、GATA1、GATA2、GNAS、HRAS、IDH1、IDH2、IKZF1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KMT2A 、KRAS、MPL、MYD88、NOTCH1、NPM1、NRAS、PDGFRA、PHF6、PTEN、PTPN11、RAD21、、SETX1 SF3B1 , SMC1A ,SMC3、SRSF2、STAG2、TET2、TP53、U2AF1、WT1和ZRSR2。

对于淋巴恶性肿瘤panel，共包含18个基因：

BCOR、BRAF、CDKN2A、DNMT3A、EZH2、FBXW7、IDH1、IDH2、JAK2、JAK3、KIT、KRAS、MYD88、NOTCH1、NRAS、SF3B1、TET2, 和TP53。

图1 研究人群中的诊断分布

MDS，骨髓增生异常综合征；AML，急性髓系白血病；MPN，骨髓增生性肿瘤；MGUS，意义不明的单克隆丙种球蛋白病；DLBCL，弥漫性大 B 细胞淋巴瘤；BALL，B-急性淋巴细胞白血病。

1、外周血NGS检测和骨髓NGS检测之间的时间间隔：

外周血与骨髓NGS间隔0～334天，平均63天。间隔小于30天80例，间隔30天以上83例。

2、外周血NGS检测和骨髓NGS检测突变分析的一致性：

（1）163 例中有 150 例 (92.0%) 显示外周血和骨髓 NGS 完全或部分一致。完全一致124例（76.1%），部分一致26例（15.9%）。13 例 (8.0%) 出现不一致；其中，所有这些都是由于在一种测试方式中检测到异常基因而在另一种方式中未检测到的。外周血与骨髓NGS相关性良好，kappa系数为0.794（kappa标准误差0.054），检验kappa的P值<0.0001（表1)。

表1：外周血NGS和骨髓NGS检测的一致性

（2）当仅包括外周血和骨髓NGS两次检测间隔时间小于30天的病例时，80例病例中的72例（90.0%）完全或部分一致，而两次检测间隔时间超过30天的病例在这个比例上没有差异（表2）。

表2：检测间隔时间对一致性的影响

（3）研究者对整个诊断组（163名患者）的一致性进行评估，结果显示不同疾病类型下的一致性存在差异（表3）。

非肿瘤性异常血细胞计数的一致性为 87.0%，kappa 系数为 0.743，kappa 标准误差 = 0.089（一致性强度 = 良好）。

髓系肿瘤（包括 MPAL）的一致性结果为 98.7%，kappa 系数为 0.916，kappa 标准误差 = 0.083（一致性强度 = 非常好）。

淋巴肿瘤显示出 83.9% 的一致性结果，kappa 系数为 0.599，kappa 标准误差 = 0.157（一致性强度 = 中等）。

表3：按诊断组分组的外周血和骨髓NGS结果的相关性

1、不一致的可能原因分析：

在非肿瘤性异常血细胞计数患者中，大多数病例 (87.0%) 的结果一致。7名患者的结果不一致；不一致的基因是DNMT3A（3名患者）、ASXL1（2名患者） 、 CEBPA （1名患者）、BCORL1（1名患者）和TP53（1名患者）。一种可能的解释是，已知代表多达三分之二的克隆性造血基因的DNMT3A和ASXL1在骨髓中以低等位基因频率被发现，但在外周血NGS中却没有检出。

在髓系肿瘤中，研究者发现MDS、MPN和MDS/MPN患者（共53名患者）从外周血和骨髓中获得的NGS结果显示出100%的相关性，类似于之前对MDS患者的研究[8.9] 。

在急性白血病患者中，27例中有25例（92.59%）符合。在骨髓和双表型白血病中观察到高度一致性 (95.83%)，而在BALL病例中观察到较低的一致性；这个结果是意料之中的，因为BALL患者偶尔没有外周原始细胞。

淋巴肿瘤在83.9%的病例中表现出一致性。这种一致性程度低于骨髓肿瘤中所见的一致性程度。由于在许多淋巴样肿瘤中缺乏循环肿瘤细胞，这一发现是意料之中的。在CLL和毛细胞白血病等外周循环肿瘤细胞淋巴样肿瘤中，外周血和骨髓在100%的病例中表现出一致性。

大多数不一致的病例在骨髓标本中检测到异常基因，而不是在外周血中检测到。在13个不一致的病例中有两个仅在外周血NGS中检测到基因，而从骨髓中获得的NGS未显示突变。这种不一致可能是由于骨髓取样时未能取得最优的样本，例如皮质下骨髓活检、颗粒状骨髓抽吸和骨髓纤维化。因此，外周血NGS可以在诊断骨髓材料有限的情况下提供额外的诊断价值。

总的来说，这些发现表明外周血NGS与骨髓NGS高度一致，尤其是在评估骨髓肿瘤时。但在某些疾病分类中仅体现出部分一致性，例如具有骨髓母细胞的高级别MDS和当外周血中存在不成比例的较低母细胞百分比时。

2、研究的局限性：

研究者认为两个样本之间的一致性在很大程度上取决于两个标本中感兴趣细胞的分布。因此，外周血NGS可能不是研究以骨髓为中心的疾病（如某些淋巴瘤）的临床实体中克隆结构的好工具。

这种方法的另一个局限性是在ALL和高级别MDS的情况下，母细胞增加，其中外周血中的母细胞百分比可能不能代表骨髓疾病负担。克服这一问题的一种方法是在外周血测序前对外周血进行流式细胞术，以提高外周血NGS研究的可靠性。