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小编精选了两篇高分文献，文献不仅仅提供了单分子测序技术在cfDNA最新研究思路，还对单分子测序技术未来发展进行详细的阐述。

文章题目：Single-Molecule Sequencing Enables Long Cell-Free DNA Detection and Direct Methylation Analysis for Cancer Patients

期刊：Clinical Chem（IF：12.167）

研究背景：

cfDNA的分析作为癌症治疗的工具已变得越来越重要。但是，先前的研究侧重于cfDNA的短片段，传统的亚硫酸氢盐测序会导致DNA降解，这使得评估长DNA特性和甲基化模式变得困难。该研究旨在通过使用单分子测序技术（例如SMRT测序）来克服这些局限性，以便在与HCC以外的特定癌症（肝细胞癌）相关的单个血浆分子水平上直接进行甲基化分析，检测更长的cfDNA。

研究方法：

该论文使用单分子实时 (SMRT) 测序对血浆DNA进行测序。研究人员对每个分子进行了片段大小和直接甲基化分析，使研究者们能够开发出一种反映与癌症相关的单分子甲基化模式的指标，即HCC甲基化分数。 为了量化肝脏贡献的血浆DNA量，研究者们采用了一种评分系统，该系统根据血浆DNA分子与其他组织（例如buffy coat、肺或结肠组织）的特定甲基化模式来确定血浆DNA分子是否可能来自肝脏。

研究思路：

对癌症患者血浆中的cfDNA分子进行测序。分析了cfDNA分子的大小分布，并鉴定了长DNA分子。通过利用单分子测序过程中的聚合酶动力学特征，对这些DNA分子进行了直接甲基化分析，并开发了HCC甲基化评分来区分癌症患者和非癌症患者。

研究结果：

该论文发现，在肝细胞癌（HCC）患者、乙型肝炎病毒携带者和健康个体中，血浆中很大一部分的DNA长度超过1 kb，其中最长的分子为39.8 kb。 肿瘤游离细胞DNA (cfDNA) 通常比非肿瘤的cfDNA短。研究人员还发现，与非肿瘤cfDNA相比，肿瘤cfDNA的甲基化水平较低。 与单独使用短片段相比，使用长分子极大地增强了癌症检测的鉴别能力。在癌症患者中发现了以前未知的长cfDNA群体，这可能为基于液体活检的诊断和单分子分辨率的原产组织分析开辟新的可能性。

研究结论：

该研究发现，在癌症患者中发现了一个以前未被确认的长cfDNA群体。这些分子的存在和直接甲基化分析为癌症液体活检开辟了新的可能性。该研究使用长血浆DNA分子中的多个cpG位点，证明了它们在区分癌症患者和非癌症患者方面的增强，为基于长cfDNA的癌症诊断开辟了新的可能性。 未来的工作还可能受益于评估其他单分子测序技术（例如纳米孔测序），以更有效地检测长cfDNA分子。

图 1 通过单分子测序显示的癌症患者的长血浆DNA分子

（A）cfDNA片段的百分比。红条表示下一代测序结果（Illumina）的百分比值，青色条表示单分子测序结果（PacBio）；（B）健康个体、HBV携带者和HCC患者的下一代测序和单分子测序中长度超过1 kb的血浆DNA分子的比例；（C）HCC患者中携带突变等位基因大小的突变等位基因（红色条）和野生型等位基因（蓝色条）的片段百分比。

图2 不同个体组中cfDNA分子的末端基序分析

将HCC（A）患者、健康个体（B）和HBV携带者（C）的细胞游离DNA分子5’端以A（红色）、T（绿色）、C（黄色）和G（蓝色）结尾的片段百分比与片段大小绘制出来

图3 （A）每个血浆DNA分子上CpG位点数量的片段相对于健康个体DNA片段不同大小范围的百分比；（B）健康个体、HBV携带者和HCC患者中来自肝脏的DNA片段的百分比

文章题目：Comparison of Single Molecule, Real-Time Sequencing and Nanopore Sequencing for Analysis of the Size, End-Motif, and Tissue-of-Origin of Long Cell-Free DNA in Plasma

期刊：Clinical Chem（CLINICAL CHEMISTRY）（IF：12.167）

研究背景：

这篇研究论文的背景是使用单分子实时（SMRT）测序来分析血浆中的长细胞游离DNA（cfDNA）。这种长cfDNA在妊娠和癌症中的潜在临床应用已被证实。然而，不同的长读测序平台在长cfDNA分析方面的性能仍然未知。通过比较两个平台上的这些结果，目标是确定每种技术特有的分析特征，这些特征应在分析过程中予以考虑，例如偏向更长或更短的片段大小。

研究方法：

作者比较了两个不同的SMRT测序平台：PacBio和ONT。他们使用超声波处理的人类和小鼠基因组DNA片段的人工混合物来评估每个平台的大小偏差。这项研究旨在调查PacBio和ONT在分析不同孕期孕妇、乙型肝炎携带者和肝细胞癌患者的cfDNA的表现差异。

研究思路：

（1）样本制备：从不同孕期孕妇、乙型肝炎携带者和肝细胞癌患者的血浆样本中提取cfDNA；

（2）测序平台：作者比较了两个用于SMRT测序的测序平台——PacBio和ONT； 

（3）创建了人类和小鼠DNA片段的人工混合物，以评估每个平台的大小偏差；

（4）数据分析：尺寸偏差评估、结尾图案概况比较、基于单分子甲基化模式的原产组织分析；

（5）检测方法：对于PacBio数据，使用名为整体动力学模型的基于卷积神经网络的模型对DNA分子进行5-甲基胞嘧啶检测；对于ONT数据检测nanopolish版本0.13.2，这是一种基于马尔可夫模型的隐藏工具，用于检测5-甲基胞嘧啶。

研究结果：

两个平台都显示出更长的序列（1500 bp比200 bp）DNA片段的偏倚，PacBio显示出更强的偏倚（长片段的5倍过度代表vsONT的2倍）。PacBio中cfDNA片段>500bp的百分比约为ONT的6倍。来自PacBio和ONT的cfDNA的末端基序谱相似，但表现出平台依赖的模式。基于单分子甲基化模式的组织来源分析在两个平台上都表现出了相当的性能。

研究结论：

（1）与纳米孔测序相比，SMRT 测序生成的长cfDNA百分比更高；

（2）与ONT相比，PacBio在分析较长的DNA片段方面表现出更强烈的偏见，但这两个平台都偏向于分析较长的片段；

（3）两个平台之间cfDNA的终端基序谱相似，但表现出平台依赖模式；

（4）基于单分子甲基化模式的原产组织分析在两个平台上均显示出相似的性能；

（5）在分析cfDNA的大小和终端基序时，重要的是要意识到每种用于分析的技术所特有的可能的分析特征和偏见。

总体而言，这项研究为使用PacBio和ONT研究不同孕期孕妇或乙型肝炎携带者或肝细胞癌患者的血浆样本中的无细胞DNA时，不同的技术如何影响结果提供了宝贵的见解。

图3 使用PacBio和ONT测序进行血浆cfDNA的单分子组织来源分析