2019年5月9日，武汉大学生命科学学院孙蒙祥团队赵鹏老师在Developmental Cell上发表题为“Two-Step Maternal-to-Zygotic Transitionwith Two-Phase Parental Genome Contributions”的研究成果，孙蒙祥老师担任文章责任作者。研究中，赵老师等研究人员对拟南芥的卵细胞、受精卵和胚胎等单细胞转录组进行了表征，证明受精卵在发育进化中存在两步母细胞向受精卵的转化（MZT）过程，且母本和父本基因组对合子转录组的相对亲本贡献具有阶段依赖性。该成果永利集团3044参与测序分析以及数据深度挖掘工作。
文章信息
中文题目：两步母细胞向受精卵的转化过程中，亲本基因组的贡献具有阶段依赖性
发表期刊：Developmental Cell
发表时间：2019.5.9
影响因子：9.616
合作单位：武汉大学生命科学学院
检索：https://doi.org/10.1016/j.devcel.2019.04.016
受精与早期胚胎发生是被子植物赖以传宗接代、形成种子的重要发育过程，长期以来一直是植物发育生物学研究领域的热点和难点。其中一个重要的发育事件是合子基因组激活(ZGA, zygotic genome activation)，合子基因激活标志着发育过程由母本控制开始转换到合子控制(maternal-to-zygotic transition)，此时胚胎开始合成自己的mRNA和蛋白质，而不再依赖于卵细胞中储藏的母本mRNA和蛋白质，意味着胚胎发育程序的建立。但植物中母本控制到合子控制转换的时间以及父、母本双方在早期胚胎发生过程的贡献，争论至今，尚无明确答案。本研究以双子叶植物拟南芥为材料，利用一系列单细胞操作技术，成功分离了深埋在母体组织内生活卵细胞、合子及早期胚胎；并利用单细胞测序技术解析了卵细胞、受精卵及早期胚胎的转录本特征，构建了目前最为完整的拟南芥卵细胞、合子和早期胚胎发生的基因表达谱数据库。
取样方法：
用DAZ3::GFP和DD45::GFP两种标记系来区分卵细胞和受精卵进行单个细胞分离。从DD45::GFP系去雄性花蕾中提取成熟胚珠，进行卵细胞分离；对DD45::GFP系进行人工阉割和授粉以分离受精卵和早期胚胎。在荧光显微镜下，分别分离出授粉后14、24小时（HAP）合子、单细胞胚胎、32个细胞胚胎。
样本选取：
卵细胞(EC)、授粉后14小时的合子--球形受精卵(Zy14)、授粉后24小时的合子--伸长受精卵(Zy24)、单细胞胚胎(1C)和32个胚胎细胞 (32C)。每个细胞类型包含3个独立的生物学重复。
测序策略：
Illumina HiSeq X Ten
技术路线：
研究结果
1、单细胞转录组数据高度可靠，转录组重构发生在受精卵中
卵细胞和早期胚胎细胞分别鉴定到13,500和17000个特异基因的转录本。col-0与拟南芥Ler杂交得到的球形和伸长合子可检测基因的数量范围为10,500至13,500，具有单核苷酸多态性，可用于区分转录本的起源并足以用于分析基因组规模的父母贡献，且数据分析显示没有来自胚乳和种皮的RNA。无监督层次聚类(UHC)和主成分分析(PCA)可将所有样品根据EC，Zy14，Zy24,1C和32C等不同发育阶段很好的聚类成五个组（图1A、B），证实RNA-seq数据的高可靠性。WGCNA 显示转录组重建发生在受精后不久，Zy14和Zy24两个阶段转录组发生显著重构（图1C、D、E）。
图1 卵细胞、受精卵和早期胚胎转录组的全局分析
2、MZT从母体转录本降解开始
在动物中，MZT包括两个重叠的过程:母体转录本的降解和ZGA。近几十年植物MZT的研究主要集中在ZGA上，目前还不清楚在胚胎早期发生的植物中是否存在母体转录缺失。作者对EC和受精卵的特异性等位基因进行比较，发现 Zy14中953个基因显著下调，Zy24中2956个基因下调。受精后的丰度变化：数百个基因在EC中表现出最高水平，受精卵中明显下调，胚胎中连续下降（图2）。其中377个基因从EC中转移过来，在合子发育时期降解。这些结果表明，母体转录本的全部清除发生在受精后不久。在MZT过程中，动物和植物的缺失过程似乎都是保守的。
图2 合子发育过程中母体转录本的缺失
3、ZGA在合子分裂前启动
研究植物中ZGA的发生时间和规模时，发现Zy14中有2625个基因显著上调，Zy24中有2951个基因显著上调(图3A)。与Zy14相比，Zy24中有1676个转录本上调(图3B)。大多数新生基因表现出两种类似的激活波，第一个在14 HAP，第二个在24 HAP(图3C)。其中693个在EC中未表达的基因在受精后不久却发生了从头转录(图3D)。GO分析显示Zy24显著富集的上调基因与细胞周期、染色体结构及细胞分裂相关 (图3E),暗示着合子发育过程中的两个从头转录阶段，可能与特异性发育时期有关。综上结果表明，ZGA在合子中以两个连续的激活波出现，对应于球形和伸长的合子阶段。
图3 全局ZGA发生在合子阶段
4、ZGA是合子生长和分裂所必需的
为在功能上确认MZT的发生，作者在体外微培养系统中使用转录抑制剂a-amanitin特异性阻断合子的从头转录(图4A)。8HAP的受精卵不能伸长，也不形成极性，并且这些受精卵从不分裂。14 HAP的受精卵，产生了大量的新生转录本(图4C)，其中大部分(91%)后续继续伸长并对称分裂(图4C和图4E)。这些结果表明，新生转录本是合子极性建立和不对称分裂所必需的。
图4 a-amanitin对从头转录的抑制阻断合子的伸长和细胞分裂
5、父母本对合子从头转录的贡献是阶段性的
为研究亲本对合子从头转录的贡献，作者分析了Zy14和Zy24的转录组，Zy14中66.1%的reads来自母体。而Zy24中发现了母代、父代的基因组序列几乎同等(图5A)。这些结果表明，父本对合子转录组的贡献呈阶段性依赖模式;第一个阶段的特征是由母本主导的转录组，第二个阶段是父母基因组的贡献相同。所有在Zy14中发现的母源表达基因(MEGs)的表达，在Zy24中转化为双亲表达(图5D)。对这些基因表达的亲代贡献进行量化后发现，在Zy24中，69.6%的MEGs表现为母系水平下降，93.6%表现为父系水平上升(图5E)。因此，Zy24从母本转录组为主导到等父母本转录组的转化主要是由于母系转录本的降解和父系转录本的表达增加。上下调等位基因的表达模式对比结果显示Zy14的母本主导转录组是由EC中存储转录组的转移而来的(图6）。
图5 亲代对合子转录组的贡献呈现出一个阶段性依赖的模式
图6 亲本基因组同时激活促成合子的从头转录
研究结论
通过表征拟南芥的卵细胞、受精卵和胚胎单细胞转录组，证明受精卵发育过程中植物MZT与动物相似，遵循一个典型的两步过程。来自母本和父本基因组对合子转录组的相对亲本贡献是阶段性的--球形受精卵的特征是母系主导的转录组，而伸长的合子转录组则呈现相等的亲本贡献。合子基因组激活是受精卵伸长和分裂所必需的，从头转录对于合子极性和胚胎发生促进的建立至关重要。
文章亮点
1、独特的分离拟南芥单细胞的技术，具有很好的参考价值。
2、WGCNA和特异性等位基因表达分析揭示植物MZT发生在受精卵发育阶段，且从母本转录组降解开始。
3、ZGA是合子伸长和分裂所必需的。
4、母本和父本基因组对合子的新生转录本的贡献相同。
5、单细胞转录组测序完整表征早期胚胎发生的动态转录本变化，为进一步研究胚胎发育奠定理论基础。
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