真核生物染色质以复杂的三维结构和开放性状态存在于细胞核中，染色质三维结构和开放性状态调控着基因表达：运用ATAC-Seq技术研究特定时空或处理条件下的全基因组处于开放状态的序列，预测调控元件，分析潜在转录因子；运用Hi-C技术研究特定时空或处理条件下的全基因组染色质序列的三维空间结构，高分辨率Hi-C互作图谱可以检测到远距离的调控元件与关键基因启动子的互作关系（enhancer-promotor loop），Loop结构可将ATAC-Seq获得的调控元件及转录因子与被调控靶基因关联，使基因转录调控研究命题更为完整和深入。
有没有一种技术一次实验就可以同时获得染色质开放性信息和染色质互作信息？ Trac-looping（Transposase-mediated analysis of chromatin looping，转座子介导的染色质分析技术）是一种结合ATAC-Seq和Hi-C核心技术点，可同时检测染色体开放性和染色质互作的创新技术。
Trac－looping实验流程
相比广泛应用的原位Hi-C技术，Trac－looping建库流程有明显区别：
（1）连接步骤在Tn5转座酶对交联后细胞的染色质开放区域酶切同时进行，转座酶在空间靠近互作的DNA上直接插入二价寡核苷酸连接子（bivalent ME linker），将靠近DNA连接；
（2）经4bp碱基酶进行片段化及生物素磁珠捕获（生物素标记在转座酶识别接头上），在T7连接酶的作用下将DNA片段分子内环化，PCR扩增环化DNA，将扩增产物进行测序。
Figure 1 Trac－looping实验流程
一次Trac-looping实验，可以捕获染色质结构的多种信息（Figure 2）：
（1）Paired End Tags (PETs)<150 bp染色质可及性区域，获得类似于ATAC-Seq信息；
（2）PETs 在150 和1,000 bp之间的染色质二级结构，包括跨越几个核小体的短距离互作；
（3）PETs 在1,000 bp以上的染色质高级结构互作，如enhancer-promotor 互作和TAD结构。
和原位Hi-C对比，Trac-looping获得的intra-TAD PETs信息更多，且数据噪音较低（Figure 3）。
Figure 2 Trac-looping获得染色质信息
Figure 3 原位Hi-C，Trac-looping，H3K4me2 ChIA-PET 的intra-TAD PETs (>1,000 bp) 占比和假阳性比例对比
Trac－looping技术应用
Trac-looping获得染色质开放区域信息
Trac-looping PETs <150bp在开放区域的富集明显高于其它区域范围的PETs，其peak峰特征与ATAC-seq 结果相似（Figure 4），说明通过 Trac-looping可获得染色质开放区域。
Figure 4 Trac-looping与ATAC-Seq结果比较
Trac-looping揭示染色质高级结构
Trac-looping不仅可识别染色质开放区域，还可以用来构建与原位Hi-C 相似的高级染色质结构。在Trac-looping PETs>200,000bp的范围可以发现与原位Hi-C相似的A/B compartments，TAD结构，heat maps互作热图(Figure a-e)，用trac-looping预测CTCF结合区域之间互作，CTCF motif高度富集（Figure f）。
Figure 5 Trac-looping揭示染色质高级结构
Trac-looping检测染色质开放区域间互作
Trac-looping PETs 富集在染色质开放区域，因此含有预测开放调控元件间互作的信息。比如，在Trac-looping数据中，可以观察到功能区域和TRIP10，VAV1启动子间明显PET 富集即互作，相反，在resting CD4+ T以及高深度测序GM12878细胞的Hi-C数据中富集较弱。
Figure 5 Trac-looping揭示检测染色质开放区域间互作
IL2RA是T细胞发育中非常重要基因，经Trac-looping数据发现IL2RA启动子与大量DHSs互作，包括IL2RA 表达中已确定的增强子PRRV区域，同时经以IL2RA 启动子作为靶基因进行Capture-C 验证（Figure 6）。
Figure 6 Trac-looping可有效检测染色质开放区域间互作
经trac-loop检测到T细胞活化前后（resting和 activated CD4+ T cells）引起的启动子-增强子相互作用变化，研究者在T cell积累过程中预测3,517 (5.5%) 和 748 (1.2%)对超敏位点 (HSs)互作发生增加和减少（Figure 7a和b）：在增加的互作区域，66%在染色质开放性上并未大幅增加（Figure 7b），例如IL2 启动子和3个假定增强子间互作，IL2 启动子开放性并无变化，但IL2 启动子和假定增强子互作增强，capture-C 和 in situ Hi-C也验证了结果（Figure 7c，黑色圆圈区域）。
Figure 7 Trac-looping重构TCRstimulation of CD4+ T cells后enhancer–promoter interaction
Trac-looping与常规3C及衍生技术不同，不需要交联后染色质片段化及邻近连接；与其他ligation-free 方法也不同，如GAM41 和SPRITE42获得的是TAD水平和远距离 (>30 million bp)的多重染色质互作，Trac-looping提供的互作信息是染色质开放性区域、近距离互作，如染色质纤维折叠及enhancer-promotor互作，是将ATAC-Seq和Hi-C核心技术结合的创新技术。
参考文献
Lai B, Tang Q, Jin W, et al. Trac-looping measures genome structure and chromatin accessibility[J]. Nature methods, 2018, 15(9): 741.
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