近日,永利集团3044喜讯连连,在最近报道基因组项目文章发表于PNAS后,又一项科研成果发表!永利集团3044与南京工业大学合作,于近期在国际知名杂志Frontiers in Microbiology上发表题为Efficient biofilm-based fermentation strategies for L-threonine production by Escherichia coli的学术论文,该研究阐述了生物膜形成和L-苏氨酸生物合成的分子基础,探索出了一种基于生物膜的L-苏氨酸固定发酵体系。
研究背景
微生物发酵是工业生产L-苏氨酸的主要方式,大肠杆菌(E. coli)是发酵产L-苏氨酸的最佳候选菌株。目前,L-苏氨酸发酵一直处于自由细胞分批发酵模式,发酵后细胞不能重复使用。这种自由细胞发酵模式会增加操作成本,降低生产率。基于生物膜的固定化发酵由于具有生物膜基质的保护作用、增强代谢活性、与自由细胞发酵过程相比细胞的重复使用等优点,被提出作为自由细胞发酵的替代方法。
I型菌膜是E. coli等革兰氏阴性菌形成生物膜的重要因素之一。fimH编码的蛋白能够被分泌并位于I型菌膜的顶部,它作为一种粘附素,发挥着生成生物膜结构的关键功能。细胞可以利用这些结构获得营养,并承受剪切力。被生物膜覆盖的大肠杆菌细胞可以耐受更严格的条件,如高渗透压、限氧、细胞密度高,这是发酵过程中所期望的特性。
技术路线
本研究首先对大肠杆菌(E. coli)进行fimH基因过表达设计形成工程菌株,以促进生物膜的形成(图1),利用载体支持生物膜构建基于生物膜的固定发酵体系。
图1 E. coli W1688中fimH过表达或敲除的结构示意图及其对生物膜形成的影响
研究者共设计得到3种工程菌株:E. coli W1688, E. coli W688-fimH*(fimH过表达)和E. coliW1688-ΔfimH(fimH敲除),分别对3种菌株发酵液进行生物膜密度,L-苏氨酸产量及葡萄糖消耗等生理生化实验测定和转录组测序研究。实验流程图如下(图2):
图2 实验流程图
研究结果
首先,我们发现fimH基因的过表达促进细胞对非生物表面的粘附,增强大肠杆菌的聚集效应,导致生物膜的形成。fimH基因的缺失对生物膜的形成有负作用。
图3 三种菌株生物膜形成的定量分析
E. coli W688-fimH*中L-苏氨酸的产量较E. coli W688增加42.9%。发酵周期从36 h缩短为32 h;E. coli W1688-ΔfimH中的产量与E. coli W688相比下降且发酵的葡萄糖消耗延迟在初始阶段。
图4 L-苏氨酸发酵生产和葡萄糖消费
转录组测序分析结果显示,fimH基因的过表达触发luxS、metK、speD和lsrR等基因表达上调,调控群体感应信号分子AI-2的生物合成,从而激活FlhD和FlhC等参与鞭毛组装和调节子的转录因子,促进生物膜的形成。
图5 生物膜生物合成途径中相关基因的转录组分析
fimH的过表达不仅导致生物膜的积累,还引起L-苏氨酸生物合成途径中相关基因的表达。fimH过表达下调乙酸酯通路中相关基因的转录水平,上调L-苏氨酸转运蛋白编码基因rhtA、rhtB、rhtC的表达,从而促进细胞外L-苏氨酸的积累,在E. coli W1688-fimH*中增加L-苏氨酸的通量。
图6 三种不同菌株L-苏氨酸生物合成途径基因的转录组分析
结 论
本研究设计的fimH过表达工程菌株E. coli W1688-fimH*在工业化培养条件下成功促进了生物膜的形成,可用于L-苏氨酸的连续固定化发酵并显著提高L-苏氨酸的产率,为开发更多基于大肠杆菌生物膜的生物化工生产工艺提供参考。
小 结
本文亮点:开发了一套基于生物膜的固定化发酵体系。文章仅仅利用原核转录组测序中差异基因聚类和功能富集分析即阐明了生物膜形成和L-苏氨酸生物合成的分子基础,发文思路是很好的典型。
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参考文献:
Tianpeng C, Na L,et al. Efficient biofilm-based fermentation strategies for L-threonine production by Escherichia coli [J]. Frontiers in Microbiology, 2019.