小小的草 迎风在摇
狂风暴雨之中挺直了腰
别笑我小 别笑我孬
风吹雨打之后依然不倒
大家好，我叫小草，今天我要和好朋友们分享我自己的故事。在我的草生中，有各种离奇曲折，如果用一个词概括那就是“水生火热”。我所在的植物家族非常庞大，千姿百态，而我非常渺小，但又无处不在。
从诞生那一刻起，我就与天地之灵气、日月之精华相伴，在它们的滋养下茁壮成长。但草生总是艰难的，过程总是曲折的，我的生命时刻受到外界的威胁，接受来自大自然的锤炼。
前一刻狂风骤雨催草折腰，后一刻艳阳炙烤干渴难熬，一个不注意，体质差点，就草命不保。但好在群众的智慧是无穷的，在漫长的奋斗史中，我的祖祖辈辈不拘一格，努力改造自身，提高抵抗力，终于迎来了百花齐放、百家争鸣的盛世景象。
其中的风云草物，为大众所熟知的莫过于生长于海边滩涂地区具有耐盐碱能力的海水稻哥哥，以及具有“耶利哥的玫瑰”之称，生存于沙漠的复活草妹妹，还有顽强扎根于高山雪线，在缺氧环境中傲霜斗雪的雪莲姐姐。对于我们这些神奇的能力，让人类的科学家们百思不解，为之着迷。为了洞悉我们的秘密，他们发起了科技革命，借助各种高科技手段，从表型特征逐渐深入到基因探测，在ATCG的排列组合中找寻生命的规律。
技能1——耐干旱
文章题目：Coordinated mechanisms of leaves and roots in response to drought stress underlying full-length transcriptome profiling in Vicia sativa L
发表期刊：BMC Plant Biology
发表时间：2020年4月
技术策略：Iso-seq、RNA-seq
材料类型：箭舌豌豆，四叶期叶片和根系
研究结果：箭舌豌豆是一种重要的自花授粉一年生草料豆科植物，为干旱易发区域牲畜饲养和人类食用提供重要的蛋白质来源。然而干旱胁迫对箭舌豌豆的生长和产量有负面影响，但其具体响应机制并不清楚。本研究，作者设置缺水24h作为处理组，以正常浇水作为对照组，对其基因表达水平变化进行检测，获得30427个全长转录本，在叶片和根系组织中分别筛选到3464个和3062个差异表达基因。通过GO和KEGG功能富集分析发现，脱水蛋白基因和Δ1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶参与到脯氨酸合成和保水过程，植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等信号通路受到显著富集。通过基因间的调控关系，推测脱落酸ABA通过调节AMY3和BAM1的活性，诱导叶片中的淀粉降解，并增加对根系的碳素输出，可能与箭舌豌豆干旱胁迫响应有关。此外，有一些转录因子AREB/ABF、bHLH、MYB、WRKY和AP2/ERF在适应干旱胁迫期间在叶片和根系中具有不同的表达模式，作者通过转基因酵母，对其进行过表达，证明了这些转录因子使酵母对渗透压的耐受性增强。此次研究从多角度阐述了箭舌豌豆的干旱应答机制，为提供作物耐寒性的基因工程研究提供了分子目标。
图1 干旱胁迫中的“植物激素信号转导”和“淀粉与蔗糖代谢”模型
技能2——耐高温
文章题目： Utilizing PacBio Iso-seq for novel transcript and gene discovery of abiotic stress responses in Oryza sativa L
发表期刊：International Journal of Molecular Sciences
发表时间：2020年10月
技术策略：Iso-seq、RNA-seq
材料类型：水稻，旗叶、花穗、发育的种子、圆锥花序、根、茎、花药、授粉后的雌蕊等组织
研究结果：水稻丰富的自然变异是研究胁迫耐受性，进行育种研究非常重要的基因资源。然而受限于数据库，很多胁迫耐受性强的水稻品种因为缺乏高质量的参考基因组，其胁迫相关基因的鉴定受到限制。作者采集3个亚种共10个水稻品种，在高温胁迫、正常处理等不同环境下的不同组织进行全长转录组研究，鉴定出37500-54600个品种特异性高质量转录本。整合后的转录本与现有的日本晴参考转录组比较，约40%的转录本为新转录本。此外，通过对耐旱耐高温水稻品种N22二代转录组数据的进一步分析，在发育的种子中筛选到的差异表达基因有56个是品种特异性的转录本，说明通过上述方法筛选到的转录本参与到胁迫应答。本研究通过多品种转录组图谱的构建为胁迫候选基因研究提供更有针对性的解决方案。
图2 耐寒耐高温水稻品种N22特异转录本
技能3——耐低温
文章题目： Isoform sequencing provides insight into freezing response of common Wheat (Triticum aestivum L.)
发表期刊：Frontiers in Genetics
发表时间：2020年6月
技术策略：Iso-seq、RNA-seq
材料类型：小麦，四叶期叶片
研究结果：作者首先对半冬小麦Zhouhai18幼苗进行预实验，-6℃分别处理0h、4h、6h、8h，然后根据幼苗的相对电解质渗漏情况和损伤程度最终选择处理4h作为处理组进行后续研究。通过全长转录组数据分析，对照组鉴定出51570个高质量的转录本和20366个基因，而低温处理组鉴定出73695个转录本和23039个基因，这些转录本与国际小麦基因组测序联盟(IWGSC)的参考转录组比较，共发现57667个新转录本，注释到21672个已知基因和3399个新基因。对照组和处理组的二代转录组数据进一步比较，共筛选到22817个差异表达基因，功能富集分析发现ICE-ERF-COR代谢通路和ABA信号转导在小麦低温应答中起到重要的作用。此外，其它转录组分析如可变剪切AS、APA位点的鉴定在本文中也进行了讨论。PB全长转录组和RNA-seq的联合为低温胁迫分子机制的解析提供了有力支撑。
图3 差异基因KEGG功能富集散点图
技能4——富集重金属
文章题目： Full-length transcriptome Assembly of Italian Ryegrass Root Integrated with RNA-Seq to Identify Genes in Response to Plant Cadmium Stress
发表期刊：International Journal of Molecular Sciences
发表时间：2020年2月
技术策略：Iso-seq、RNA-seq
材料类型：黑麦草，根系
研究结果：镉是一种有毒的重金属元素，非常容易为植物所吸收，从而进入到食物链中，导致人体镉中毒。意大利黑麦草作为一种重要的饲料广泛种植在世界温带地区，能在镉污染较为严重的区域生存，具有应用到植物修复重金属污染土壤的潜能，但其具体运转和富集调控机制并不为人所知。本文作者联合全长转录组和二代转录组技术，以50 µmol/L Cd处理6h作为处理组和正常处理作为对照组，对于没有参考基因组的同源四倍体黑麦草构建了一个全长的UniTransModels作为参考转录组，注释到146545个转录本，其中29.76%的全长models有超过一个转录本，且实现了在genome-free的情况下揭示了AS事件的复杂性。进一步通过基因表达水平比较分析，共筛选到2367个差异表达基因参与镉胁迫应答，并对其中的LmAUX1基因在拟南芥中进行过表达，发现拟南芥中镉含量显著提高。这些结果提高了对黑麦草镉胁迫应答的遗传多样性和复杂性的认知，为基因鉴定和分子育种提供了宝贵的遗传资源。
图4 LmAUX1基因拟南芥过表达Cd富集实验
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