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        肠道菌群在炎症性肠病（IBD）中起着至关重要的作用，可能对溃疡性结肠炎或克罗恩病有治疗作用，以肠道菌群为靶点为IBD患者提供了一种新的治疗策略。研究人员通过构建小鼠慢性结肠炎模型，结合流式细胞术技术、非靶向代谢组学、16s rDNA测序分析、功能预测分析、粪菌移植等多种研究方法进行研究，结果表明，大黄酸可以显着缓解DSS引起的慢性结肠炎，通过调节肠道菌群，间接改变肠中嘌呤的代谢，从而减轻结肠炎，确定了一种临床治疗结肠炎的新方法。

        溃疡性结肠炎(UC)是一种局限于结肠粘膜和大便、腹痛和体重减轻的炎症性肠病，发病率为7.6-246‰。UC的病因仍不清楚，可能涉及免疫功能障碍、遗传易感性和微生物失衡。大黄酸是大黄、芦荟、番泻叶等中药的主要成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、抗氧化等多种药理作用。然而，大黄酸是否可以改善结肠炎及其可能的机制仍然知之甚少。大量研究证实，微生物区系在IBD中起着关键作用。恢复微生物区系稳态和肠道屏障功能可能是对抗UC或IBD的有效方法，一些益生菌已经被证明可以直接调节IBD。

大黄酸

材料：C57BL/6J小鼠；小鼠粪便、血清

方法：

DSS诱发慢性结肠炎；

流式细胞术分析；

代谢组学分析；

16s rRNA基因测序及数据分析；

qPCR分析；

粪菌移植；

1.大黄酸减轻DSS诱导的小鼠慢性结肠炎

        评估大黄酸是否能在小鼠慢性结肠炎模型中发挥抗炎作用。经4轮2%DSS处理后，小鼠出现严重的结肠炎。100mg/kg大黄酸处理可缓解结肠缩短，而50mg/kg和100mg/kg大黄酸处理组的免疫细胞浸润和组织损伤均低于DSS组。DSS治疗引起小鼠肠道炎症的敏感标志物粪便脂钙蛋白-2(Lcn2)显著增加，50mg/kg和100mg/kg大黄酸处理可逆转这一现象。

        结肠炎还会导致促炎细胞因子或趋化因子的产生增加。DSS慢性治疗使小鼠血清中IL-17A和CXCL1的产生显著增加。100mg/kg大黄酸可逆转DSS组小鼠结肠中IL-17、CXCL、干扰素-γ的显著升高，而IL-10浓度在各组间无显著差异。DSS治疗后血清IL-17/IL-10比值升高，而大剂量大黄酸显著下调结肠IL-17/IL-10比值(图S1B-C)。由于IL-17主要由Th17细胞分泌，与结肠炎密切相关，接下来检测了小鼠肠系膜淋巴结(MLN)中的Th17细胞。与血清中IL-17水平一致，100mg/kg大黄酸处理组小鼠的MLN中Th17细胞较少，而50mg/kg大黄酸处理组则没有影响，Th1/Th2细胞失衡也是结肠炎的重要事件。结肠炎时Th1细胞显著扩张，而DSS组Th2细胞明显减少。有趣的是，大黄酸治疗只降低了Th1细胞，而对Th2细胞几乎没有影响。结果表明，大黄酸处理可明显改善DSS诱导的结肠炎，且100mg/kg大黄酸处理效果优于50mg/kg大黄酸处理。

图1.大黄酸减轻DSS诱导的慢性结肠炎

(A)实验设计。(B)小鼠模型发育过程中的相对体重(n=8)。(C)每组有代表性的结肠图片。(D)每组(n=8)结肠长度。(E)各组结肠组织切片常规HE染色。(F)各组的组织学评分(n=5)。(G)各组大鼠粪便中炎症标志物Lcn2水平(n=8)。DSS：葡聚糖硫酸钠；Rh：大黄酸。

2.大黄酸改变嘌呤代谢，降低尿酸水平

        代谢变化被认为是肠道疾病最重要的标志之一。研究者通过使用非靶向代谢组学来确定小鼠肠道中可能发生改变的关键代谢物和代谢途径。在粪便中共鉴定出159种代谢物，3D-PCA分析显示DSS组和100mg/kg大黄酸组之间存在差异。选择了差异表达的代谢物(倍数变化>2，p值<0.05)进行进一步分析，并确定了两组之间的23个差异表达的代谢物。

        为了进一步研究可能的代谢途径，使用MetabAnalyst进行了途径富集分析。分析了粪便中的尿酸水平，发现DSS导致尿酸浓度显著增加，而大黄酸治疗消除了尿酸浓度的升高。综上所述，结果证实了结肠炎时嘌呤代谢途径发生了改变，大黄酸治疗使嘌呤代谢恢复正常，降低了肠道尿酸水平。

图2.大黄酸改变了小鼠肠道的代谢特征

(A)对粪便中代谢物的3D-PCA分析显示，DSS组和大黄酸处理组(n=6-8)的代谢物组成不同。(B)差异表达代谢物的路径富集分析。(C)嘌呤代谢示意图。尿酸是最终的代谢物。(D)各组的相对尿酸浓度。

3.尿酸升高直接导致肠屏障受损

        测试了尿酸是否会导致肠道屏障完整性的破坏。单用尿酸7天未见明显炎症反应，少数免疫细胞浸润。通过FITC-葡聚糖渗漏到血液中，观察到了更高的肠道通透性。紧密连接蛋白claudin-1和细胞黏附蛋白E-cadherin的表达减少，如图2C所示，还观察到杯状细胞分泌的粘液层变薄，粘蛋白-2分泌减少。相反，大黄酸恢复了claudin-1、E-cadherin的表达和粘液分泌。尿酸治疗降低了claudin-1和E-cadherin的表达，尿酸处理加100mg/kg大黄酸处理对DSS诱导的慢性结肠炎也表现出很强的保护作用，表明补充尿酸不影响大黄酸的保护作用。这些数据表明，大黄酸处理可以消除尿酸引起的肠通透性增加。

图3.在没有DSS的情况下尿酸破坏肠道完整性

(A)各组结肠组织切片常规HE染色。(B)用FITC-葡聚糖血清浓度测定肠漏(n=4)。C.不同组别结肠切片中E-钙粘蛋白、Claudin-1和粘蛋白-2的免疫荧光分析。显示了具有代表性的图像。(D)结肠组织切片上的阿尔新蓝染色；黑色箭头显示内粘液层的厚度。(E)NCM-460细胞用尿酸处理24小时，Claudin-1和E-cadherin的典型免疫荧光图像。

4.大黄酸不能直接降低尿酸浓度

        研究人员进一步探讨了大黄酸治疗改变嘌呤代谢的潜在机制。由于尿酸是嘌呤代谢途径的最后一步，是黄嘌呤和次黄嘌呤在黄嘌呤脱氢酶/氧化酶(XDH)作用下的产物，因此研究人员首先研究了大黄酸能否在转录水平上影响XDH。用不同浓度的大黄酸处理NCM-460细胞，发现两组之间没有任何差异。接下来，测定了大黄酸处理的培养细胞上清液中的尿酸浓度，没有观察到任何明显的变化。这些数据表明，大黄酸可能不是肠道嘌呤代谢的直接调节者。

5.大黄酸治疗改变肠道微生物区系组成，增加乳酸杆菌水平，导致尿酸水平下降

        尽管大黄酸处理不能直接降低尿酸浓度，但会导致体内尿酸水平降低。利用16S核糖体RNA基因测序来确定大黄酸治疗是否会改变肠道微生物区系组成。基于UniFrac的3D-PCA分析显示了每组微生物区系组成的明显聚集性。与DSS组相比，100mg/kg大黄酸处理组的乳杆菌属有更高的丰度。使用STAMP分析和定量PCR进一步证实了这一发现。所有的分析结果表明，大黄酸处理后乳酸杆菌数量显著增加，因此，粪便中的乳酸浓度增加。乳酸杆菌是最著名的益生菌之一，补充乳酸杆菌可以减轻IBD。利用相关分析确定了乳酸杆菌水平与配对尿酸浓度之间的关系。乳酸杆菌丰度与小鼠肠道尿酸浓度呈负相关，表明乳酸杆菌在嘌呤代谢中起着关键作用。

        研究人员使用PICRUSt2从16s rDNA测序数据中预测了细菌基因组的含量。与100mg/kg组相比，DSS组的嘌呤代谢中关键酶的表达（包括xdh，ade，xdhA，xdhB，yagT和guaB）没有上调。实际上，在大黄酸处理组中观察到这些酶的轻微增加，排除了尿酸浓度差异主要由细菌引起的可能性。最后通过粪菌移植（FMT）实验，结果表明FMT在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中导致尿酸减少。大黄酸可以改变肠道菌群的组成，并导致乳酸杆菌的丰度增加，从而减少肠道上皮细胞中尿酸的产生。

图4.16s rDNA测序表明大黄酸处理后微生物区系组成发生了变化

(A)对每组(n = 5)进行基于PERFNOVA的基于UniFrac的3D-PCoA分析。(B)top10属水平相对丰度。(C)属水平LEfSe分析结果。(D)STAMP分析揭示了DSS和大黄酸处理组之间的差异。(E)乳杆菌属的16s rDNA拷贝。(F)与DSS组比较，每个组中粪便中乳酸浓度。

6.FMT改善DSS诱导的结肠炎和恢复肠屏障功能

        使用FMT来确定大黄酸改变的肠道微生物区系是否对结肠炎有治疗作用。将DSS或100mg/kg大黄酸处理小鼠的粪便微生物区系移植到DSS受体体内。FMT通过16S rDNA测序和qPCR进行验证。进一步分析了从供体小鼠和受体小鼠获得的16S rDNA数据。STAMP分析显示DSS+Rhein组与FMT组有不同的细菌菌株，包括Synechococcus、Prochlorococcu、Oscillibacter、Soleaferrea、Candidatus、Actinomarina和OM60(NOR5)分支。然而，这些细菌的相对丰度极低(<0.01%)，因此不太可能在不同的类群中发挥生物学功能。这些数据进一步支持了微生物区系从供体鼠到受体鼠的成功转移，FMT显著减轻DSS诱导的结肠炎，减少结肠组织切片中免疫细胞的浸润。此外，FMT组E-cadherin和claudin-1表达增加，提示粘液层厚度恢复，FMT保护了肠道渗漏。与DSS组相比，FMT组的乳酸菌水平也有上调。这些数据表明，FMT改善了DSS诱导的结肠炎，防止了肠道屏障通透性；进一步支持了在DSS治疗过程中大黄酸改变微生物区系有利于结肠炎的观点。

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