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近日，遗传学领域TOP期刊Annual Review of Genetics（IF=16.83）在线发表了题为“Plant Cell Identity in the Era of Single-Cell Transcriptomics”的综述长文，该综述系统性介绍了植物单细胞测序的研究进展，以及单细胞测序如何提升我们对植物细胞多样性、分化和活性的理解，并指出了单细胞转录组在植物应用和分析方面面临的挑战和机遇。

图1  文章发表信息

植物单细胞转录组研究进展

一个细胞RNA种类的收集反映了细胞的活动、结构和历史，因此转录组分析为定义和区分细胞身份提供了有效的方法。在单细胞转录组之前，已存在细胞分类方法（如激光捕获显微切割技术、荧光标记FACS）可以在一定程度上提供对特定组织或细胞类型的表达图谱，但无法区分细胞个体间的差异以及同一组织内细胞或同一细胞的不同状态。而单细胞转录组研究，则可完美解决上述问题。

图2  植物转录组研究策略比较

截止到2021年9月，目前已有单细胞转录组报道的植物包括拟南芥、玉米、水稻、番茄等，涉及的组织/器官包括根、叶、种子、幼穗、幼苗等。概括来说，目前植物单细胞转录组研究主要分为两类：一类是对原生质体进行RNA测序（single-cell RNA-sequencing），另一类是只使用细胞核进行测序（single-nuclei RNA sequencing）。

表1  植物单细胞转录组研究进展

对原生质体的测序目前主要是基于10X Genomics的Chromium平台，其原理是通过控制微流体的进入，将带有引物序列的凝胶珠与单细胞、酶混合，形成一个GEM ( Gel in Emulsion )的液滴结构，实现单细胞的分离。基于原生质体的单细胞转录组测序已经定义了来自各种植物器官和组织的成千上万个单独细胞的转录组，这些结果表明细胞存在明显的转录异质性。但scRNA-seq也存在一些显著的局限性，例如转录本检出率低（小于20%）、降解细胞壁会引起15%-20%的基因表达发生变化（即获得的转录本与体内真实状态不一致）。

只对单个细胞核进行测序的sNucRNA-seq可以获得更真实的转录表达信息，且不用担心细胞类型的大小。对拟南芥根组织进行的sNucRNA-seq研究表明，与scRNA-seq相比，sNucRNA-seq可以定义出新的细胞类型。此外，进行sNucRNA-seq分析可以更容易地捕获和评估转录异构体以及可变剪切信息。后续sNucRNA-seq研究中，一个重要的目标是优化细胞核分离，以减少转录信息的遗漏及RNA的降解。

单细胞转录组助力解析不同的植物细胞类型

单细胞转录组学的主要吸引力之一是能够高清晰度地评估特定细胞类型的基因表达，其最终目标是从整个植物器官生成完整的细胞类型基因表达图谱。

细胞类型分配的一般方法是先从转录组的无监督聚类开始，然后在每个聚类内聚集所有细胞的转录积累，随后使用已知的细胞类型表达基因将细胞类型分配到特定的聚类中去。利用单细胞转录组识别植物细胞类型的第一个应用是拟南芥的根组织，对于其他物种或器官，转录组簇的细胞类型分配具有更大的挑战性，在某些情况下可以基于拟南芥的同源基因或初步的实验结果来识别细胞类型。

转录组数据聚类和细胞类型分配也存在着一些重要问题。第一，由于人为因素，在面对未知样品的转录组数据聚类，研究人员可能会新建或丢掉某一特定细胞类型，进而导致错误的细胞类型；第二，由于非特异性、低水平表达或细胞缺乏特异性标记基因会给确定细胞类型带来困难；第三，由于一些细胞类型自身缺乏显著的定义，研究人员就无法确定两个转录组细胞群是属于不同的细胞类型或是同一细胞的两种亚型、两种状态等。

图3  单细胞转录组数据分析

单细胞转录组也可以帮助我们识别植物中稀有的和新颖的细胞类型，例如拟南芥根中的静止细胞（占比＜0.1%）、侧根的起始细胞（LRP），还可以帮助我们从已知类型细胞中定义细胞亚型（例如从拟南芥内皮层细胞中定义两个新的细胞亚型）。此外，拟南芥单细胞转录组等的研究结果表明细胞类型特异性表达比一般假设的要少得多。

单细胞转录组助力植物细胞动态过程的研究

单细胞转录组能够捕获和评估样本中的数千个单个细胞，从而能够对细胞的动态过程进行前所未有的分析，如细胞在发育过程中的身份转换、对生物或非生物因素胁迫的反应。

植物在构建动态发育过程中的一个固有优势是可以利用分生组织进行连续的胚后器官发生，后续通过连续作图来反映发育时间和谱系之间的关系（例如根分生组织）。通过轨迹推断，我们可以从单细胞转录组数据中分析细胞转换（根表皮、叶表皮等），更重要的是这些轨迹已被用于定义基因表达模式的伪时间特异性差异，从而能够识别这些分化程序下的新的假定调控基因。轨迹分析的一个挑战是沿具有生物学相关性的路径定义适当的转录组分组(即细胞状态)，这需要评估沿途的转录动力学，包括使用工具来估计RNA速度，这可以发现基因表达模式的不连续变化（例如确定玉米雄性生殖细胞分化过程中与减数分裂事件相关的三个主要表达变化）。

在面对环境变化时，例如非生物胁迫或危害，植物通常以发育的方式进行积极响应，而单细胞转录组则可以帮助我们了解在响应环境变化过程中细胞特性的转变（例如拟南芥根细胞对热刺激的响应、水稻茎细胞对氮胁迫或盐胁迫的响应、物理损伤后植物再生过程的变化等）。

图4  玉米减数分裂的发育流程

此外，我们可以在不同物种中比较同一种单细胞类型的基因表达，来解决一些与进化相关的问题，例如推断细胞类型的系统发育、推断细胞身份的进化起源。目前通过比较水稻和拟南芥的单细胞转录组数据集，发现两种物种的根毛细胞在转录组谱上有显著相关性，而皮层细胞在转录组谱上有适度相关性，而其它组织未能表现出类似的相关性，这可能需要更近缘物种之间的单细胞转录组比较来弥补差异。

总  结

尽管目前植物单细胞转录组研究尚处于起步阶段，但其发展十分迅猛，预计未来会有更多植物或器官的单细胞研究报道，这些研究解决的科学问题将从单一的构建单细胞图谱转变成在单细胞水平上解析发育、细胞行为和进化机制。而展望未来，通过提高scRNA-seq对mRNA的捕获效率、优化原生质体和细胞核的分离，都可促进植物单细胞甚至植物单细胞多组学（结合单细胞转录组学、染色质可及性-ATAC、DNA甲基化和蛋白质组学）的研究。

图5  植物单细胞转录组研究思路