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2022年1月，东北农业大学动物科学技术学院杨秀芹教授团队在《Biomolecules》上发表题为“Characterization of Alternative Splicing Events in Porcine Skeletal Muscles with Different Intramuscular Fat Contents”的研究论文。研究利用Iso-Seq和RNA-Seq技术，探究了猪不同肌肉间的可变剪接事件（AS）和肌内脂肪（IMF）沉积模式，研究丰富了现有的基因组注释并揭示了不同品种和组织间的AS差异，确定了影响IMF沉积的重要因素，为深入探索肉质和IMF沉积的机制提供了基础。永利集团3044参与本研究的二三代测序及分析工作。

图1 文章信息

Iso-Seq数据概述

背最长肌（LT）和半腱肌（ST）是具有不同生化和组织学特征的两种肌肉，被广泛用于肉质研究，与ST相比，LT更嫩、水分更少，亮度更高，IMF含量更高。本实验选择了三头成年民猪，分别取LT和ST，各组织等量混合RNA后进行三代测序，并使用二代数据进行校正，获得了281,522条高质量的FLNC，用于进一步分析。这些FLNC覆盖59,075个转录本和31,243个基因座，其中9623个为已知基因。在59,075个转录本中，34,188个是多外显子，24,887个是单外显子。82.93%的多外显子FLNC与参考数据库中的mRNA具有相同的起始位点，也表明Iso-seq数据在RNA结构方面具有高度完整性。

图2 Iso-seq数据分析

新基因鉴定

通过Iso-seq发现了56,789个新转录本，其中包含22,184个未注释基因座的新转录本和34,605个注释到基因座的新转录本。未注释基因座的22,184个新转录本中，94.46%为单外显子且只有极少数存在多转录本情况。通常编码蛋白基因为多外显子且绝大多数进行了可变剪接，因此22,184个新转录本中参与蛋白编码的转录本比例很低。对这22,184个转录本进行注释筛选，最后得到80个新的蛋白质编码基因。同时也鉴定出了11,371个LncRNA和19个融合基因。在19个融合基因中，18个发生在染色体间，1个发生在染色体内，说明染色体间为融合基因主要来源。

图3 Iso-seq鉴定新基因

选择性剪接事件

通过Iso-seq分析，发现了456,965个AS事件。通过RT-PCR对6个基因（1个lncRNA和5个蛋白质编码基因）的AS事件进行了验证，说明了Iso-seq在检测AS中的准确性。同时许多基因的新转录本被发现，也说明了Iso-seq是表征AS的有效工具。如CKM基因，在参考注释中只存在三个转录本，但通过Iso-seq发现了743个转录本。结合此前对约克郡猪的Iso-seq的研究，发现即使相同基因在不同品种和组织中也存在转录本亚型和数量差异。说明，AS具有品种和组织特异性，同时也暗示在猪基因组中还存在更多的转录本有待发掘。

图4 Iso-seq分析AS事件

差异选择性剪接事件（DAS）

使用外显子包含（EI）事件与包含/去除外显子事件的表达比来评估AS水平，并计算两种肌肉之间的差异（△EI）。确定了3930个DAS事件，与LT比较，ST中2016个上调，1914个下调，差异主要集中在ES和MEE两种DAS类型中。3930个DAS事件对应到2364个基因，对DAS基因进行GO和KEGG注释，GO表明主要富集在生物过程中的生物调节和代谢过程；KEGG分类表明DAS基因参与各种途径，有37个基因参与脂质代谢，KEGG通路分析也表明各种途径与脂肪形成有关。

图5 综合Iso-seq和RNA-seq表征DAS事件特征

差异选择性剪切与差异表达基因整合分析

综合Iso-seq和RNA-seq数据综合分析DAS基因对LT和ST表型差异的影响。比较两种肌肉之间的mRNA表达。与LT相比，ST中鉴定出了1174个DEG（683个上调，491个下调）。这些DEG中，有122个是DAS基因，即DE-DAS基因，其中70个上调，52个下调。DE-DAS基因功能富集分析表明，其主要集中在生物过程和脂肪相关途径中。进一步分析表明，上调的DE-DAS基因参与了更多的脂肪形成途径，这表明，上调的DE-DAS基因是导致LT与ST之间IMF含量差异的关键因素。脂肪酸降解和PPAR信号通路是调节两块肌肉脂肪沉积差异的最重要通路。

图6 与LT相比，ST中DE-DAS基因的表征

DE-DAS基因中的转录因子（TF）

通过使用数据库注释，共有111个DEG被确定为TF。与LT相比，ST中有71个TF上调和40个TF下调。这些差异表达的TF（DE-TFs）中，16个是DAS基因（DE-DAS-TFs）对DE-DAS-TFs进行PPI分析，表明ACTN2和RNF41在调节DEG中起关键作用。

图7 差异可变剪接（DAS）中差异表达转录因子（DE-TFs）表征

Iso-seq具有无需打断、读长更长的技术特点，在可变剪接及融合基因等结构信息方面具有极大的优势。上述研究充分利用了Iso-seq的技术优势，鉴定出了大量新转录本和AS事件。揭示了AS和转录本的品种和组织特异性。此外，研究进一步鉴定出了影响LT和ST二者间IMF含量的重要因素和关键途径。新转录本和AS的鉴定，说明了Iso-seq技术的优势和研究潜力，本研究中也多次通过实验验证了Iso-seq在新转录本鉴定、AS事件的结果的准确性，进一步说明了Iso-seq的准确可靠。