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2022年3月Advanced Science在线发表了题为“Single-Nucleus RNA Sequencing Reveals that Decorin Expression in the Amygdala Regulates Perineuronal Nets Expression and Fear Conditioning Response after Traumatic Brain Injury”的研究论文，该研究通过单细胞核转录组测序技术确定了杏仁核中不同的细胞类型，并分析了对照组和创伤性脑损伤组之间这些细胞类型中的差异基因，以揭示神经周围网络（PNN）在创伤性脑损伤中表达变化的机制以及恐惧条件反射与经周围网络之间的关系。

图1 文章发表信息

（大脑）杏仁核细胞成分的鉴定

研究者从3个对照样本和3个TBI样本的小鼠脑部急性冠状脑切片中分离出杏仁核，并对杏仁核中的中央杏仁核（CEA）和基底外侧（BLA）杏仁核区域进行了解剖（图2A）。6个样本共捕获79946个细胞核，高质量细胞核72328个。通过聚类分析细胞群，共有7种细胞类型（图2B,C）。注释结果表明神经元由抑制性神经元（Gad1和Gad2）和兴奋性神经元（Slc17a7）组成，非神经元细胞聚集为星形胶质细胞（Gja1、Aqp4和Acsbg1）、小胶质细胞（C1qa、C1qb和Ctss）、内皮细胞 （Flt1和Cldn5）、少突胶质细胞（Oligos） （Aspa、Ermn和Mog）和少突胶质前体细胞 （OPCs）（Pdgfra 和 Cacng4）（图2D,E）。

图2 基于 snRNA-seq 数据的小鼠杏仁核细胞类型分类

杏仁核中具有不同基因表达的神经元亚型

神经元细胞群是杏仁核中体积最大和多样性最高的细胞群，并且能以形态、解剖位置和组织学特征进行分类，此次共确定了 14 个转录不同的亚型（图 3A）。每个神经元亚型通过一个或多个marker基因组合的独特表达来识别（图 3B）。Allen Brain Atlas 中观察了这些标记基因的RNA原位杂交 (ISH) 结果并确定这些基因表达的解剖位置（图 3C）。簇 0、1 和 3 的标记基因Ppp1r1b、Rspo2 和 Hgf在 BLA 中表达。簇4、5、9、10和13的标记基因Scn5a、Prkcd和Drd2主要在CeA中表达。簇 2、6、7、8、11 和 12 的标记基因Tshz1、Moxd1 和 Zmat4在 BLA 和 CeA 中都有表达。此外，根据 Slc17a7 和 Gad1 的表达确定了这些神经元的兴奋和抑制特性（图 3D）。通过标记基因表达的位置及其神经元特性将神经元分为4个亚型：BLA-Exc神经元（11 630个神经元）、BLA-Inhib神经元（ 7391 个神经元）、CeA-Inhib 神经元（13264 个神经元）和 CeA/BLA-Inhib 神经元（10980 个神经元）（图 3E）。

图3 杏仁核包含不同的神经元亚型

TBI 改变不同细胞类型中的基因表达

为了研究不同细胞类型marker基因在TBI中的发病机制，作者分析了两组样本的差异基因，发现有102-333个基因在不同的细胞类型中改变（图4A）。通过功能富集分析来研究这些转录变化如何影响各种细胞类型的功能（图4B），研究结果表明在杏仁核的细胞类型中，TBI涉及多种途径：Th17细胞分化、原发性免疫缺陷和癌症中的途径与星形胶质细胞有关；核糖体、铁死亡和Hippo信号通路在内皮细胞中发生了改变；基底细胞癌、氧化磷酸化和神经活性配体受体相互作用与寡核苷酸有关。此外，原发性免疫缺陷、细胞因子-细胞因子受体相互作用和TGF-β信号通路在OPC中发生了改变；BLA-Exc神经元中的ECM受体相互作用、癌症中的蛋白聚糖和粘着斑发生了改变；BLA/CeA-Inhib神经元的TNF信号通路、Toll样受体信号通路和ErbB信号通路发生改变。此外，细胞粘附分子、脂肪消化吸收、BLA-Inhib神经元中PPAR信号通路发生改变，CeA-Inhib神经元中EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、戊糖和葡萄糖醛酸相互转换和酪氨酸代谢发生改变。Decorin （Dcn）是兴奋性神经元中的最高DEG，被发现在BLA-Exc神经元中特异性表达（图4C）。此外，ISH数据显示Dcn在BLA中表达，但在CeA中不表达（图4D），这与snRNA-Seq数据一致。推测Dcn可能通过降低杏仁核中PNN的表达来调节突触可塑性，并影响TBI引起的焦虑行为或恐惧条件反射。

图4 对照组和TBI组之间每种杏仁核细胞类型的广泛转录差异

创伤性脑损伤（TBI）后杏仁核Dcn表达上调的验证

snRNA-seq结果表明，TBI组的Dcn表达显着增加。首先，使用FISH评估Dcn与BLA中相应的兴奋性神经元标记基因slc17a7的共定位。结果表明，在BLA中Dcn由兴奋性神经元合成，TBI后其表达明显上调（图5A）。此外，对未处理小鼠和TBI小鼠的杏仁核进行了批量RNA-seq分析来验证snRNA-seq结果。结果表明，Dcn是bulk RNA-seq鉴定的DEG之一（图5B），维恩图分析显示，根据bulk RNA-seq和snRNA-seq结果，77个基因的表达发生了变化（图5C）。RT-qPCR结果显示，杏仁核中TBI后Dcn mRNA水平显着增加（图5D）。最后，通过免疫荧光（IF）分析和Western印迹观察到，BLA中TBI后Dcn的蛋白质表达水平显着增加（图5E，F）。

图5 验证 Dcn 表达在 TBI 后 BLA 中上调

Dcn敲除增加PNN表达来减轻TBI相关的恐惧条件反射

杏仁核是处理恐惧和焦虑的核心大脑区域。研究者通过在AAV-hSyn-cre-EGFP和Dcn flox/flox小鼠体内敲除Dcn，确定了Dcn在恐惧条件反射和焦虑行为中的作用（图6A）。AAV注射3周后，RT-qPCR结果显示Cre AAV注射组BLA中Dcn的表达显着降低（图6B）。首先，恐惧条件反射（FCR） 的结果表明，Dcn敲除减弱了TBI诱导和提示恐惧反应，这些变化与chABC注射时观察到的变化相同（图6C）。为了研究Dcn的分子机制，评估BLA和PNN的水平。IF结果显示，TBI降低了PNNs的表达。在TBI小鼠中，chABC注射不会影响BLA中PNN的表达，而与对照AAV注射组相比，Dcn敲除增加了PNN的表达（图6D）。结果表明，在TBI小鼠的BLA中chABC注射后PNNs+Gad67+神经元数量减少，而PNNs+CaMKII+神经元与TBI组相比没有变化；与对照组AAV注射组相比，Dcn敲除后 PNNs+CaMKII+的数量减少，而PNNs+Gad67+ 的数量在两组之间没有变化（图6E，F）。

图6 Dcn敲除增加了PNN的表达并减弱了TBI诱导的恐惧条件反射

Dcn敲除可以恢复TBI相关的谷氨酸-GABA失衡

研究者通过蛋白质印迹观察了Gad67和NR1的表达水平，它们分别表示GABA和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体水平。TBI后BLA中的NR1水平增加，而Gad67水平没有变化。在TBI小鼠的BLA结果显示chABC注射后Gad67水平升高，而NR1水平与TBI组相比没有变化；与对照AAV注射组相比，Dcn敲除后NR1水平降低，而Gad67水平没有变化（图7A，C）。与对照组相比，TBI导致BLA 中兴奋性突触的平均长度和深度显着增加，而两组之间的抑制性突触没有差异（图7B、D、E）。在TBI小鼠的BLA中，研究者观察到chABC注射后抑制性突触的平均长度显着增加，而两组之间的兴奋性突触没有差异；Dcn敲除后，与对照组AAV注射组相比，观察到兴奋性突触的平均长度和深度显着减少，而两组之间的抑制性突触没有差异（图 7B、D、E）。这些结果表明Dcn是由兴奋性神经元合成的，并且在TBI后表达水平增加。Dcn的高表达可以特异性地减少兴奋性神经元周围的PNN 数量，并导致BLA过度兴奋，最终导致恐惧条件反射增加。

图7 Dcn敲除维持了TBI后BLA中的谷氨酸-GABA平衡

Col6a3蛋白与Dcn物理相互作用

液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS）用于检测与Dcn发生物理相互作用的蛋白质，并阐明Dcn抑制PNNs表达的可能分子机制。如图8A所示，在抗Dcn抗体免疫沉淀的产物中观察到对应于≈40kDa的明显条带。然后对免疫沉淀和IgG条带进行后续的LC-MS/MS分析；结果表明，胶原蛋白VI α 3 （Col6a3）和胶原蛋白XVII α 1 （Col17a1）与Dcn发生物理相互作用，并且是 ECM的组成部分。HT22细胞中的免疫共沉淀（co-IP）和小鼠 BLA 组织中的IF分析显示Dcn 和Col6a3之间存在物理相互作用（图8B，C）。然而，没有观察到Dcn和Col17a1之间的物理相互作用。Western blotting结果显示，与对照组相比，TBI后BLA中Col6a3的表达降低；而在TBI小鼠的BLA中，Dcn敲除可以增加Col6a3的表达（图8D）。总之，作者建议在TBI后，Dcn通过Col6a3诱导PNN上调并导致BLA中的谷氨酸-GABA失衡，最终导致恐惧条件反射增强（图 8E）。

图8 Col6a3蛋白结合Dcn

在这项研究中，首先使用snRNA-seq来识别小鼠脑部杏仁核中的不同细胞类型及其独特的转录特征。差异基因分析显示每种细胞类型中的基因转录在TBI后都发生了显著的变化。然后，作者敲除小鼠BLA中Dcn的表达；行为测试显示TBI诱导的FCR降低，形态学分析表明，在TBI小鼠的BLA中Dcn敲除后PNNs的表达增加。最后，作者研究了与Dcn物理相互作用的蛋白质。这项研究对TBI诱导的恐惧条件反射的分子机制的提供新见解，并确定Dcn是TBI后PTSD治疗的新靶点。