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今年5月25号Nature在线发表了题为“Developmental dynamics of two bipotent thymic epithelial progenitor types”的研究论文。基于CRISPR-Cas9的高分辨率条形码方法与单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 相结合，可识别胚胎和成人胸腺上皮细胞（TEC）群体中的双能祖细胞，并显示它们的发育关系。这种双重方法能够确定两个主要的祖细胞群：偏向于皮质上皮的早期双能祖细胞类型和偏向于髓质上皮的出生后双能祖细胞群。并且进一步证明Fgf7的持续自分泌导致胸腺微环境的持续扩张，而不会耗尽上皮祖细胞池，这表明了一种调节胸腺生成活性程度的策略。

图1 文章信息

研究人员使用scRNA-seq技术来检测4周龄小鼠CD45-EpCAM+TECs的细胞异质性。得到的聚类图（UMAP）与之前的研究一致（图2a），说明了上皮区室在基因表达谱和簇大小方面的复杂性；接下来，确定上皮隔室内的候选祖细胞群，c6、c11和c19的转录结果非常相似，并且对c1具有亲和力，c1本身与c5、c8和c13相连（图2b）。祖细胞和成熟TEC基因组的聚合表达水平在4周龄小鼠的UMAP图中标记了四个不同的结构域（图2c-f）。为了可视化TEC隔室中与年龄相关的动态变化，计算了每个细胞簇的早期和出生后祖细胞 (EP/PP) 以及成熟cTEC和mTEC种群 (C/M) 的转录评分比率，并参考图绘制它们到P28时间点（图2g-i）。虽然E16.5 TEC隔室由与早期祖细胞和成熟cTEC非常相似的细胞主导（图2g），但P0时间点反映了从胚胎到成人TEC隔室的转变。1年时间点的特点是成熟的TECs很少（图2i）。在这个阶段，与相应的P28细胞簇相比，大多数填充出生后祖细胞区室（c2、c6、c7、c8和c9）的细胞簇表现出EP/PP比率增加。研究者将具有这种模糊表型的TEC称为“老年祖细胞”（图2i，j）。

图2 胸腺上皮细胞（TEC）之间的细胞异质性

为了进一步探索TEC隔室中潜在的祖-后代关系，研究者开发了一种基于CRISPR-Cas9介导的Hprt基因外显子3瘢痕形成的高分辨率谱系追踪方法（图3a、b），之前的报道中表明所有的胚胎和成人TECs都有Foxn1表达，可称其为“疤痕”（3c）。在早期胚胎发生过程中引入胸腺雏形的单个上皮细胞中，这些标记在后代细胞中均会出现。与其他条形码方案的情况一样，独个的“疤痕”（以下称为条形码）以不同的频率生成（图3d），每个胸腺的不同条形码总数约为500-1,000（图3e），成年小鼠中观察到数量约为300-1,800。来自同一只小鼠的mTEC和cTEC样本中此类罕见条形码的显著共现程度表明cTEC和mTEC具有共同的祖先（图3f-g）。接下来应用scRNA-seq和条形码追踪来剖析不同年龄小鼠的TEC室内的祖-后代关系（图3h-k）。总的来说，这些结果说明了当这种方法与单细胞分辨率的转录组数据相结合时，使用条形码方案在鉴定和表征祖细胞群及其后代时的优势。

图3 CRISPR-Cas9的条形码系统显示了祖种群的分化能力

研究者结合scRNA-seq和谱系分析来检查TEC隔室在连续成纤维细胞生长因子 (Fgf) 信号传导条件下的细胞组成。在该转基因模型中，上皮隔室内连续自分泌Fgf7增加了TECs和胸腺细胞的数量（图4a-c），并导致胸腺大量持续增加（图4d）。在慢性Fgf刺激条件下仍会发生与年龄相关的胸腺生成减少；然而，老年转基因小鼠的胸腺仍然比P28野生型小鼠大得多（图4d）。因此，减少Fgfr2b配体的供应有助于TEC数量与年龄相关性减少。祖细胞和成熟TEC的特征，图3h中总结的特征。P28处Fgf刺激的TECs的谱系关系显示存在由两种类型的祖细胞和成熟cTECs和mTECs共享的条形码以及连接祖细胞类型和cTECs的条形码（4e-i）。1岁小鼠的谱系结构显示大量未产生分化后代的祖细胞（图4j）。其他出生后祖细胞产生了cTECs或mTECs。与偏向谱系的祖细胞的优势相比，双能祖细胞很少见。总的来说，这些数据表明TEC祖细胞不会因自分泌Fgf刺激而耗尽，而是对老年小鼠的微环境做出突出贡献。

图4 自分泌Fgf刺激导致胸腺持续的增生

该研究为早期和出生后小鼠双能祖细胞对胸腺上皮微环境的形成和维持提供了确凿的证据，并揭示了TEC生物学的几个新方面：

1. 早期cTEC偏向祖细胞类型和出生后mTEC偏向祖细胞类型，在胚胎发育期间出现并在E16.5共存，这表明出生后一些双能祖细胞可能是早期祖细胞群。

2. 在两个祖细胞群中识别出私有条形码表明，并非所有TEC祖细胞都同时活跃，这种现象可称为休眠。

3. 成熟的cTECs和mTECs中私有条形码的存在表明其相应的祖细胞可能已经丢失，这与并非所有祖细胞都是长寿的概念一致。

4. 由于TECs的半衰期是在第7周测量的，得出结论是TEC隔室的长期维护与此处确定的出生后祖细胞的活动有关。

5. 祖细胞群的鉴定为有针对性的药物干预提供了新的机会，以调节胸腺微环境的活性。