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图1.褪黑素促进植物生长、发育和抗逆性的潜在途径

图2.技术路线简图

01 褪黑素可以缓解盐、干旱和热应激

为了研究褪黑素能否缓解木豆的盐、干旱和热胁迫（42℃），分别使用褪黑素（处理组）和缓冲液（模拟组）浇灌1个月大的土培木豆进行预处理。在没有施加压力的情况下，模拟组和处理组植物生长没有明显差异。但在盐、干旱和热胁迫下，褪黑素组能缓解由于胁迫造成的叶片卷曲、发黄、枯萎等情况，这也与我们检测到的生理指标一致（MDA、电解渗透压）。应激处理后，与模拟组相比，褪黑素组MDA含量和电解渗透性均降低。胁迫会导致叶片中的叶绿体减少，但褪黑素处理可以缓解这种情况。说明，褪黑素预处理可以显著缓解木豆的干旱、盐和热胁迫。

图3.褪黑素预处理缓解木豆的盐、干旱和热应激

02 褪黑素诱导类黄酮积累

为了揭示褪黑素增强木豆胁迫耐受性的机制，对不同时间节点的木豆根进行了代谢组研究。褪黑素组和模拟组比较发现，128种代谢物受到褪黑素的显著影响。我们对重要的差异代谢物（DAM）进行了热图分析，表明褪黑素显著诱导了代谢物的富集。特别是黄酮类化合物，在53种黄酮类化合物和黄酮C-糖苷中，47种代谢物显著增加，6种减少。对DAM进行KEGG富集并结合代谢数据库绘制了黄酮途径，结果显示，DAM主要富集在木犀草素及其下游代谢物，表明在木豆中木犀草素及其衍生物对褪黑素的反应最强。

总的来说，结果表明褪黑素在促进黄酮类化合物的生物合成中起到了重要作用，这些代谢物对植物抗氧化和抗逆有积极作用。褪黑素可以通过调控植物对类黄酮的生物合成，特别是木犀草素及其衍生物，来提高对压力的适应能力。

图4.代谢组学分析揭示了褪黑激素对木豆根中代谢物的影响

03 褪黑素诱导木犀草素生物合成基因表达

为了进一步了解褪黑素对代谢物积累影响的潜在机制，我们对褪黑素处理后的不同时间点的根进行了转录组测序。通过比较0、12和72小时的测序数据得到了差异基因（DEG），比较DEG发现，褪黑素处理木豆后在不同的时间节点表现出显著的动态变化，在72h后逐渐恢复到稳态。

研究已发现，褪黑素显著影响类黄酮的生物合成，因此分析重点为相关的苯丙烷途径，特别是DAM富集的木犀草素及其衍生物途径。我们发现通路中也存在许多基因出现表达变化。其中上调的酶基因中，参与木犀草素的生物合成的CcF3’H是重点关注基因。

为了进一步探究褪黑素对代谢物合成途径的调控，基于DAM和DEG的相关性，构建了关联网络。鉴定出414个MYB和bHLH TF与类黄酮关联；5个TF与木犀草素相关，其中CcPCL1与木犀草素呈正相关。RT-PCR也验证了转录组的结果。

结果表明：褪黑素可能通过CcPCL1 TF和CcF3’H调控木犀草素及其衍生物的积累。

图5.褪黑素诱导后苯丙烷途径中的DEG和DAM

04 CcF3’H-5的过表达提高木豆的盐胁迫耐受性

褪黑素处理后有5个CcF3’H家族基因差异表达，通过构建的干旱、盐和热胁迫模型，检测了CcF3’H家族表达的差异变化，发现CcF3’H-5的表达水平在各胁迫下最高，且对盐胁迫的反应最为剧烈。

为了探究其对盐胁迫反应的作用，构建了CcF3’H-5过表达木豆与CcF3’H-5沉默木豆植株。褪黑素的预处理后，进行盐胁迫处理，结果表明CcF3’H-5过表达木豆的叶片情况明显好过CcF3’H-5沉默木豆。同时褪黑素预处理显著提高了对照株和CcF3’H-5沉默木豆叶片的性能。这表明，CcF3’H-5的过表达可以提高木豆的耐盐性。

图6.CcF3’H-5转基因木豆毛状根在盐胁迫下的性能

05 CcPCL1正向调控CcF3’H表达，提高木豆耐盐性

此前研究发现CcPCL1在干旱、盐和热胁迫下表达量较高，并且可能存在对CcF3’H-5的调控作用。进一步通过酵母单杂实验也发现CcPCL1可以与CcF3’H-5的启动子区域结合。

为了进一步探究CcPCL1的功能，构建了CcPCL1过表达和沉默瞬时转基因木豆植株。发现除了CcPCL1外，过表达木豆中CcF3’H-5的表达水平也显著高于对照植株，沉默木豆则相反。盐胁迫处理后，发现褪黑素处理后的CcPCL1过表达木豆叶片情况也显著好于未褪黑素处理的CcPCL1过表达木豆；且CcPCL1沉默木豆的叶片状态也差于对照组。这也支持了CcPCL1正向调控CcF3’H表达，提高木豆耐盐性的观点。

图7.CcPCL1正向调控木豆的耐盐性