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图1  文章发表信息

霍乱是由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）感染所导致，其是一种感染人小肠的肠道病原菌，以霍乱毒素和毒素毒性调节菌毛作为毒力和定植为主要因素，霍乱分泌霍乱毒素（CT），会破坏肠道上皮的正常离子运输，导致大量水外流到肠道，导致腹泻和呕吐。霍乱为我国甲类传染病，也是国际检疫传染病。2018年，也门经历了历史上最严重的霍乱疫情，同时，非洲一些国家也创下了该病死亡率的最高记录。WHO专家估计，在世界范围内每年大约有 130万至400万例霍乱，导致2.1～14.3万人死亡。直到今日, 全球每年仍有约10万人死于霍乱。多年来，有研究表明一些直接靶向毒力因子或毒力信号的工程或自然共生体在动物模型中使霍乱弧菌感染的定植抗性或清除可能。本研究中，研究者首先在小鼠肠道中识别出对霍乱弧菌感染有害影响的肠道共生体。通过从成年小鼠的小肠和大肠中筛选出100多株经乳糖发酵的肠道细菌分离物，发现了少数能够有效抑制霍乱弧菌生长的菌株，并且确定了pks大肠杆菌对霍乱弧菌DNA的损伤作用，并探讨了它们对肠道微生物群的生态影响。

材料：

• 10只CD-1小鼠的肠道内容中筛选出100多株经乳糖发酵的肠道细菌分离物；

• CD-1成年小鼠的小肠中分离出大肠杆菌EMS1；V. cholerae El C6706为野生型菌株。

测序策略：二代宏基因组+扩增子测序

1.小鼠肠道大肠杆菌可接触依赖性杀灭霍乱弧菌

研究者从小鼠肠道分离出的大肠杆菌EMS1，在体外即可杀死霍乱弧菌。研究人员鉴定了9株显著抑制Vc生长的菌株，然后进行了定量液体分析，证实：这些菌株抑制了Vc的生长，与Vc单培养相比，有效地将Vc种群从3个减少到5个数量级。16S rRNA测序结果表明，9株Vc高抑制菌株均为大肠杆菌。以大肠杆菌K12菌株MG1655或MP1共培养作为对照。后续又发现：不同比例的Vc和EMS1共培养，显示出EMS1对Vc生长的剂量依赖性抑制作用。重要的是，在EMS1存在的情况下，Vc种群在崩溃前增长到对数中期，鉴定了9株显著抑制Vc生长的菌株。这表明EMS1有效地杀死了Vc。Vc对低pH敏感，但EMS1的杀伤作用不是由于生长培养基的酸化，因为有和没有EMS1共培养的培养物之间的pH是相似的。当使用分子量为10 kda的透析膜分离Vc和EMS1时，EMS1对Vc不再表现出杀菌作用，这表明杀菌作用可能依赖于接触。另一种解释是，细胞膜可以阻止EMS1产生的活性化合物到达Vc。

图2  肠道共生大肠杆菌具有抗弧菌活性

2.EMS1产生大肠杆菌素负责抗霍乱弧菌活性

科研人员为了研究EMS1杀死Vc的分子机制，通过转座子诱变EMS1进行遗传筛选，并筛选失去抗弧菌活性的突变体。测序分析显示，突变体均在pks基因组岛的不同位点插入了转座子，负责合成大肠杆菌素（BGC）。在clbN中构建了框架内缺失突变体，该突变体编码参与大肠杆菌素生物合成起始的合成酶，在clbL中编码大肠杆菌素成熟所需的酰胺酶。EMS1中clbN或clbL的删除完全取消。证明EMS1可产生直接拮抗弧菌的大肠杆菌素，该成分是EMS1 抗弧菌活性的本质原因。

图3  EMS1产生抑制霍乱弧菌生长的大肠杆菌素

3.EMS1产生的大肠杆菌素可抑制霍乱弧菌在小肠中的定植

研究人员为了证明EMS1是否影响Vc在体内的定植问题，研究团队使用链霉素处理的成年小鼠模型来进行测试。研究发现，与空白接种相比，预接种EMS1的小鼠的Vc定植减少了近100倍，而ΔclbN突变体的预定植并不影响Vc的定植。然而，这一结果并不是由于EMS1本身的差异定植，因为野生型EMS1和ΔclbN突变体在小鼠小肠中的定植效果相同。这些数据表明，EMS1抑制了Vc在体内的定植，并且该抑制作用依赖于大肠杆菌素的产生。同时，使用鸟枪法宏基因组测序还发现，肠道微生物组中大肠杆菌素的存在可能与人类接触霍乱弧菌后症状严重程度有关。

图4  大肠杆菌素影响霍乱弧菌的定植

4.大肠杆菌素诱导霍乱弧菌的SOS响应和微需氧条件下活性氧的积累

与微好氧条件相比，有氧条件下生长的EMS1不能杀死Vc。clbB是clb操纵子的第一个基因。测量了clbB-lacz转录融合的表达，发现clbB在限氧条件下表达更高，这与霍乱弧菌在感染过程中遇到的静态微氧条件下更有效的杀伤观察相一致。由于大肠杆菌素杀死Vc的机制是通过诱导DNA损伤实现的，对EMS1杀伤具有抗性的细菌可能具有更有效的内源性DNA修复机制，对破坏性刺激的响应更快。此外，影响细菌SOS反应的其他因素也可能导致弧菌对大肠杆菌素的敏感性不同。

图5 大肠杆菌素诱导霍乱弧菌的SOS反应和ROS积累

5.肠杆菌素的产生与对肠道共生细菌的强烈影响有关

作者进一步的研究发现：在ASYM和SYM组中观察到比UNI群体更相似的微生物丰度模式，后者表现出更高的组内变异。根据小鼠肠道微生物组纤维发现，脆弱杆菌在ASYM和SYM组的clbþ个体中均显著减少。结合体外存活试验，弧菌外的抗菌作用或菌株。在复杂的粪便群落中，大肠杆菌素驱动的个体物种丰度的差异也可能通过靶向微生物同步营养关系的成员间接介导。综上，表明在人类和小鼠的体外和体内，大肠杆菌素的产生与对肠道共生细菌的强烈影响有关，这为这种共生细菌来源的基因毒素在塑造肠道微生物群和调节致病菌的传染性方面发挥了作用提供了直接证据。

图6 大肠杆菌素驱动小鼠和人类肠道菌群重构

研究者从成年小鼠肠道中鉴定了一个pks⁺ B2家族共生大肠杆菌EMS1，它可以拮抗霍乱弧菌生长和体内肠道定植。EMS1的抗弧菌活性取决于基因毒素大肠杆菌素的产生。并证明了EMS1大肠杆菌蛋白破坏细菌DNA并重塑宿主肠道微生物群，从而证明了共生体产生的基因毒素在促进宿主肠道微生物群动态方面的多方面作用。该研究有助于我们理解哺乳动物肠道中微生物间的相互作用。研究结果为探索肠道多细菌相互作用在感染和疾病结果中的更大作用提供了一个新平台。