表面上皮是来自外胚层一侧的单层上皮，能够进一步分化为具有保护作用、可以进行物质交换和感知外界环境变化的上皮组织。表面上皮细胞的适当发育对于正常的表皮发育和功能至关重要。胚胎干细胞（ESC）分化过程中的谱系命运需要染色质重组和谱系特异性基因的激活，全面剖析这些顺式调控元件和核心转录因子在启动细胞系命运期间的相互作用，可以充分了解发育的转录命运。
细胞命运的转变通常伴随着形态的重塑，不同类型的细胞表现出不同的形态。形态发生是由细胞力学通过细胞骨架元素以及细胞粘附和基质分子驱动的，与细胞特性和功能高度相关。在ESC分化为表皮细胞期间，细胞形态学相关基因可用于区分细胞身份，通过其模式变化来定义细胞命运的转变具有重要意义。
近日，中山大学中山眼科中心欧阳宏团队在Science Advances（IF：14.136）上发表了题为“ Cis-regulatory chromatin loops analysis identifies GRHL3 as a master regulator of surface epithelium commitment ”的文章。该研究利用RNA-seq、ChIP-seq、Promoter Capture Hi-C（PCHi-C）和ATAC-seq等多组学方法，根据细胞形态学相关基因（MRG）的动态变化确定了从人类ESC（hESC）到表面上皮细胞（SE）命运转变的关键点，并在SE分化的起始阶段确定了细胞特异性的顺式调控元件-启动子相互作用。在靶向顺式调控元件的转录因子中，GRHL3通过改变全局染色质状态，激活SE身份特性基因，并与BMP4形成正反馈，是调控SE命运的核心转录因子。本研究将MRG特征与细胞命运转换联系在一起，为研究SE特异性调控元件提供了全面的资源，对再生疗法的发展大有裨益。永利集团3044承担了该研究中的Promoter Capture Hi-C建库测序和部分分析工作。这也是该团队继前不久发表角膜缘干细胞的表观调控研究文章（NC重磅项目文章丨Hi-C多组学助力解析人角膜缘干细胞功能的表观调控机制）后的又一篇重磅研究成果！
图1 文章发表信息
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SE身份的分化阶段
该研究首先基于一个改良的、hESCs定向分化成SE细胞的模型，在第7天（D7）获得了几乎和SE同质的细胞群，并根据SE标志性marker和ESC marker染色来确定其特征。根据在SE分化过程中观察到的主要时间性基因表达模式，发现细胞形态学相关基因（MRG）可被归纳为三组，呈现出显著不同的表达模式，GO分析结果与细胞骨架、细胞连接、细胞粘附和细胞基质相关，细胞骨架成分的变化证明分化的第二天是SE启动的关键过渡阶段。与之相一致的是，在D0到D2期间，多能性相关基因（NANOG和OCT4）的染色质可及性和表达量明显下降，而SE标志物（KRT7、KRT8和KRT18）呈上升趋势。这部分分析发现，MRG的动态特征可用于识别SE的命运转换，SE的分化过程可分为三个阶段：多能性阶段（D0）、SE起始阶段（D2）和SE分化-成熟阶段（D3-D7）。
图2 SE分化过程的表观动态特征和模型
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SE身份的关键顺式调控网络
接下来，该研究通过PCHi-C、ChIP-seq和RNA-seq来综合分析SE起始阶段的调控网络。PCHi-C可获得高分辨率的启动子相关染色质相互作用，SE起始阶段细胞的PCHi-C确定了70572个重要的染色质相互作用，包括SE标记(KRT8、KRT18和KRT19)的许多启动子染色质环。其中大多是启动子和非启动子区域之间的互作。随后用ChromHMM基于四种组蛋白修饰推断SE起始细胞中的染色质状态。与没有增强子的启动子相互作用区域相比，启动子-增强子相互作用的数量和其目标基因的表达方面表现出更高的水平，突出了增强子-启动子互作的顺式调控网络的积极调节作用。
随后通过顺式调控网络的靶基因和SE起始阶段的高表达基因，确定了593个两者共有的基因，将它们定义为SE身份特性基因。GO分析中SE身份基因显示出与上皮细胞发育、基于肌动蛋白丝的过程和组织形态发生的明显关联，揭示了SE身份特性基因在SE命运决定中的潜在作用。为了确定驱动SE的主要转录因子，从SE身份基因中筛选了42个候选转录因子，并通过CHiCAGO评分对其进行排名。其中包括有几个上皮细胞发育的主要调控因子。在前10个转录因子中，HAND1、GRHL3和CDX2的表达模式都与TFAP2C相似，后者在SE起始阶段急剧增加，在SE成熟阶段迅速减少。
图3 多组学分析解析SE起始阶段的顺式调控网络
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GRHL3打开染色质并介导SE身份基因表达
该研究选择GRHL3来研究它在决定SE命运中的作用。首先使用CRISPR-Cas9生成了GRHL3基因敲除的hESCs。敲除后的分化细胞失去了上皮样的形态，SE特征基因广泛下调。并且这些细胞的ATAC-seq和GSEA分析进一步证实，SE特征基因位点周围的染色质可及性大大降低。
SE起始阶段的GRHL3 ChIP-seq分析表明，GRHL3的结合位点主要是远离靶基因的转录起始位点的区域。调节SE的motif中，TFAP2C和GRHL2两个转录因子明显地结合在GRHL3的结合位点，表明GRHL3可能与这些因子合作以介导SE起始阶段。值得注意的是，绝大多数的SE特征基因（72.5%）结合有GRHL3，表明GRHL3主要通过直接结合来激活SE特征基因。比如，GRHL3与TFAP2C、KRT7和KRT8/18附近的位点结合，增强了它们的染色质可及性和基因表达，而在没有GRHL3的情况下，情况则不然。因此GRHL3在打开SE身份基因染色质和激活其表达方面有重要作用。
图4 GRHL3与TFAP2C、KRT7和KRT8/18附近的位点结合，增强染色质可及性和基因表达
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GRHL3驱使SE分化
鉴于GRHL3在SE起始阶段中的重要作用，该研究调查了GRHL3是否能驱动SE分化。为此，在hESC中采用多西环素诱导系统来过表达GRHL3。诱导7天后，GRHL3过表达的细胞（以下简称为 "TetO-GRHL3+"）显示出均匀的KRT18+上皮样形态，并伴随着SE标志基因的明显高表达。相比之下，这些细胞的多能性和神经外胚层相关基因都明显减弱。GO分析表明，TetO-GRHL3+细胞中优先表达的基因与上皮细胞发育的生物过程有关。PCA分析中，TetO-GRHL3+细胞的转录组景观与SE起始细胞的转录组景观高度相似，两种细胞有类似的MRG表达模式。此外，与TetO-GRHL3-细胞相比，TetO-GRHL3+细胞中的KRT7、KRT8、KRT18和TFAP2C位点的ATAC-seq信号大幅增加。转录因子motif富集分析显示，GRHL、AP2和GATA家族的结合明显增加，而与hESC多能性相关的关键转录因子的结合则减少。总的来说，GRHL3足以驱动SE表型的获得。后续在角质细胞成熟培养基中进一步培养TetO-GRHL3+细胞，也的确成功分化成为角质细胞。
图5 GRHL3驱使SE分化
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SE分化期间BMP4和GRHL3存在正反馈回路
接下来研究者剖析GRHL3是如何推动SE分化的。通过整合TetO-GRHL3+细胞的PCHi-C数据和SE起始阶段细胞的GRHL3 ChIP-seq数据，观察到GRHL3更频繁地出现在与启动子相互作用的区域。将GRHL3介导的启动子相互作用组与转录组数据相结合，发现在TetO-GRHL3+细胞中，有607个上调基因的启动子参与了GRHL3介导的启动子互作，包括SE特异性角蛋白（KRT7、KRT19、KRT8和KRT18）和关键SE调节子（GRHL3和TFAP2C）。这些基因富集于几个信号通路，其中BMP信号是主要的。通过分析BMP家族成员在SE起始过程中的表达变化，发现BMP4的表达在SE起始细胞和TetO-GRHL3+细胞中最为突出，表明BMP4的激活参与了SE的分化。
使用BMP的抑制剂DMH-1处理TetO-GRHL3+细胞，SE分化过程GRHL3的表达明显被抑制，表明GRHL3作为BMP4信号传导的下游调节子发挥作用。中断BMP通路后，分化的hESCs未能获得类似上皮的形态，SE marker（TP63）的表达也无法检测到。在BMP4刺激1天后，TP63+细胞的比例明显增加，突出了BMP4信号在SE命运中的指导作用。综上，BMP4和GRHL3之间存在正反馈回路，而且这个回路是SE命运所必需的。
图6 SE分化期间BMP4和GRHL3存在正反馈回路
总 结
该研究通过监测细胞形态学相关基因（MRG）的动态表达变化，定义了SE分化过程中的起始和成熟阶段，通过PCHi-C等多组学联合分析，全面评估以前未被发现的顺式调控元件和特定的转录因子，发现GRHL3为SE命运的“启动因子”。该研究为揭示细胞命运决定的原则提供了改进策略，突出了顺式调控元件和启动子之间发生的细胞特异性相互作用，推进了表观遗传学在调控SE谱系规范方面的研究。
图7 文章分析思路总结
中山大学中山眼科中心欧阳宏研究员和王力副研究员为该论文共同通讯作者，黄华兴博士为第一作者。该研究得到了国家自然科学基金国际合作与交流项目、国家自然科学基金和广东省创新创业研究团队计划的支持。
参考文献：
Huang H, Liu J, Li M, et al. Cis-regulatory chromatin loops analysis identifies GRHL3 as a master regulator of surface epithelium commitment. Science Advances, 2022, 8(28): eabo5668.
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