系统性红斑狼疮（SLE）是一种复杂的自身免疫性疾病，其特点是自体抗体的产生、T淋巴细胞和B淋巴细胞的失调以及免疫复合物的形成，导致多器官损伤。SLE的发病机制在表观遗传学层面的研究十分广泛，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。不过，针对SLE患者的三维基因组研究很少，三维基因组改变与SLE疾病活动之间的关系以及三维基因组改变在自身免疫相关基因表达中的潜在调节作用仍待探究。
近日，中南大学湘雅二医院皮肤科、中国医学科学院皮肤病医院陆前进教授与赵明教授合作以“3D genome alterations in T cells associated with disease activity of systemic lupus erythematosus”为题，在国际知名医学杂志Annals of the Rheumatic Diseases（IF：27.97）发表了SLE研究成果。该研究结合Hi-C、RNA-seq、ATAC-seq motif富集分析和组蛋白修饰（H3K27ac, H3K4me1, H3K4me3）等信息，破译了SLE患者T细胞的三维染色体结构，发现它与健康对照组显著不同，并且与SLE的疾病活动密切相关。重要的是，该研究确定了与SLE的疾病活动和不同表达基因有关的染色质loop，以及靠近这些loop的一些关键组蛋白修饰，还证明了转录因子SPI1对干扰素通路基因过表达的调控贡献，SPI1的motif位于SLE发生变化的loop中。此外，该研究还确定了遗传变异对系统性红斑狼疮三维基因组改变的潜在影响。永利集团3044承担了该研究中Hi-C等表观多组学数据的部分分析工作。
图1 文章信息
材料方案
研究材料：7个SLE患者和5个健康人的外周静脉血，分选得到CD4+ T细胞
研究方法：
组学数据：Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq
其他方法：qRT-PCR、CRISPR/Cas9、荧光素酶实验、SPI1 siRNA转染、3C-qPCR、ChIP-PCR
研究结果
1.CD4+细胞在SLE患者中的三维结构变化及其相关差异基因
首先，该研究在7名SLE患者和5名健康对照组（HC）外周血的CD4+T细胞进行Hi-C实验，确定两组对象的三维基因组结构，包括A/B compartment、TAD和loop结构。PCA分析显示，在考虑每个SLE患者的SLE疾病活动指数（SLEDAI）情况下，12个人的TAD边界和loop强度与其存在一定的规律。SLE疾病越重，SLE患者和HC在TAD边界和loop强度的差异越大。
接下来，研究通过Hi-C测试的SLE样本和HC样本之间的基因表达（RNA-seq）确定差异表达基因（DEG）。DEG的GO富集有许多免疫功能，覆盖了大约80%的DEG。从中提取免疫反应基因和囊泡基因，用于在所有样本中通过PCA剖析与其重叠的TAD边界或loop特征，结果进一步明确了这些基因的三维结构变化可以将SLE患者与HC区分开来，并且与SLEAI评分正相关。
图2 12个样本中免疫反应基因和囊泡基因相关TAD边界和loop存在差异
2.391个与SLEDAI和不同表达基因相关的loop
SLEDAI相关loop和基因表达之间的关系可以通过交叉分析进行量化，研究确定有391个SLE相关的loop，它们的强度与SLEDAI和差异表达基因都有关联。在所有样本中，SLEDAI的变化与SLE相关loop强度变化存在一致性。功能富集和通路分析显示，391个具有SLE相关loop的基因主要与炎症和免疫相关的生物过程有关。例如流感感染、toll样受体7/8或9信号传导中TRAF6介导的IRF7激活、NLRP3炎症体。不仅如此，SLE相关loop在所有样本中拥有更大的长度，并且更多是长距离的TAD间loop，而这些SLE相关的TAD间loop是由TAD边界周围的弱绝缘分数决定的。
图3 SLEDAI的变化与SLE相关loop强度变化存在一致性
在SLE loop相关基因表达的变化分析中，研究比较RNA-seq数据和已发表的CD4+T RNA-seq数据，分析SLE loop相关基因的相对表达并进行qRT-PCR验证。结果显示，与HC相比，SLE患者CD4+T细胞中DDX60L、LTBP1、CXCL13、SLC8A1、ATG5和IFIT1的表达明显都上调，FCER1A和HDC的表达都下调。
图4 SLE loop相关差异表达基因
3.SLE相关基因位点的三维结构变化
90%以上的SLE相关loop是基于增强子或启动子的相互作用，研究重点关注SLE相关loop的基因位点时，观察到有两个SLE相关loop与DDX60L基因启动子重叠。DDX60L是一个ATP依赖性的螺旋酶基因，参与先天免疫的IFN抗病毒反应。在DDX60L上，SLEDAI分数较高的SLE患者有更强的互作频率。此外，患者的SLEDAI分数越高，该基因座的loop强度和基因表达也越强。荧光素酶报告实验也显示DDX60L启动子区loop促进了其转录。此外，在DDX60L启动子内，活性组蛋白标记H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3在两个loop锚点富集；SPI1是最常在两个loop锚点富集的转录因子。当抑制SPI1表达时，DDX60L表达受到适度抑制，H3K4me3和H3K27ac水平也有所下降。在SPI1敲除的CD4+T细胞中进行ChIP-qPCR和3C-qPCR验证时，SPI1能够结合DDX60L的启动子区域，转染SPI1 siRNA使DDX60L启动子的远端loop互作减少。因此，在SLE患者的CD4+T细胞中，DDX60L基因座的转录调控是由SPI1、组蛋白修饰和染色质相互作用控制。
图5 DDX60L基因座的转录调控是由SPI1、组蛋白修饰和染色质相互作用控制
已知SPI1与CD4+T细胞的Th9表型有关。Th9细胞和IL-9参与了SLE的发病机制。该研究中，Th9细胞相关基因（IL9、BATF、IRF1、ETV5、NFATC2和FOXO1）在SLE患者CD4+T细胞中的表达明显上调。当在Th9细胞敲除SPI1时，IL9和BATF的表达明显下降。此外，其他SLE相关的loop相关基因，如CXCL13、SLC8A1-AS1和DNAJB4，也表现出和DDX60L类似的模式-即患者的SLEDAI分数越高，基因座的loop强度和基因表达也越强。不过也有一些SLE相关loop并非如此，如CASP5附近的loop。
4.SLE相关SNP的三维结构变化
在SLE相关SNP的三维结构变化中，研究比较SLE患者和HC之间SNP位点的loop强度差异时，关注到了一个SLE相关的SNP，rs13385731。与HC相比，rs13385731区域的相互作用在SLE患者中有所增加。根据ENCODE的ChIP-seq（H3K4me1、H3K4me3和H3K27ac）的富集情况，该SNP位点与一个激活的增强子重叠。在SLE样本中，携带rs13385731的增强子区域形成较长的互作loop，这可能影响LTBP1的局部染色质构象和基因表达。LTBP1是TGF-β途径的一个组成部分，它与细胞外基质中的纤维蛋白-1结合以使TGF-β失活。
图6 SLE相关SNP rs13385731的三维结构变化及特征
此外，rs2732549 SNP和APIP和SLC1A2在同一个TAD中，APIP和SLC1A2是SLE CD4+T细胞的DEG。这个TAD内有许多互作，APIP和SLC1A2附近存在强的增强子标记（H3K4me1和H3K27ac）。该区域是CD4+T/CD8+T细胞的超级增强子。另一个与SLE相关的SNP rs2245214，位于发生有远距离互作的loop锚点。而SLE患者大多数远距离相互作用都有所增加。考虑到SNP rs2245214与参与自噬泡形成的基因ATG5重叠，这可能与SLE患者中ATG5过表达有关。
小 结
在该研究中，通过应用三维基因组和表观遗传方法分析了SLE中CD4+T细胞的三维基因组改变和转录调控机制，确定了差异表达基因的系统性红斑狼疮相关的loop。该研究绘制了SLE中发生了变化loop位点的三维基因组图谱，并证实了转录因子SPI1在干扰素（IFN）-I途径相关基因的潜在影响。
在本研究中，中南大学湘雅二医院皮肤科赵明教授和冯德龙博士为共同第一作者，赵明教授和陆前进教授为共同通讯作者。永利集团3044刘琳博士署名参与了本研究。该工作得到了国家自然科学基金、CAMS创新工程基金、湖南省科技创新国际与区域合作重点项目和湖南省科技领军人才项目的支持。
参考文献：
Zhao M, Feng D, Hu L, et al. 3D genome alterations in T cells associated with disease activity of systemic lupus erythematosus[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2022.
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