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衰老会影响男性的生殖能力，然而在分子和基因组水平上，衰老如何影响人类生殖及睾丸的支持细胞很大程度上是未知的，本研究利用单细胞转录组测序技术，研究人类睾丸衰老的一系列分子机制。

八名老年(>60岁)和四名年轻(17-22岁)的男性的睾丸组织。

1、细胞分群与细胞类型鉴定

首先对来自12个样本的共44,657个细胞进行聚类分群，然后根据各cluster的marker基因表达情况对其进行鉴定。确定了体细胞和生殖细胞类型，包括：支持细胞、巨噬细胞、内皮细胞、间质细胞、管周细胞、平滑肌细胞、未分化和分化精原细胞、精母细胞和减数分裂后精子细胞。以下为示例图：以下为示例图：

2、细胞发育分析

根据标记基因将生殖细胞发育分为7个阶段：精原干细胞，分化精原细胞，早期初级精母细胞，晚期初级精母细胞，精子圆细胞，延长型精子细胞和长形精子细胞。然后分析每个样本中各类生殖细胞亚型的占比，统计老年组的3个睾丸样本中生殖细胞分化程度来观察与衰老的异质性影响。条形图显示每个个体的主要生殖细胞类型的百分比。根据精子发生情况，将具有完全精子发生的老年供称为老年组 1，具有生精功能障碍的老年供体则被称为老年组2，并进一步探索睾丸老化和衰老导致的男性亚生育的潜在分子机制。以下为示例图：

3、关键细胞类型在不同年龄段的差异分析

统计每种细胞类型年轻 vs 年长男性的差异表达基因（DEG），重点关注了两种及两种以上的体细胞类型共有的DEG，对共有的上调基因和下调基因分别进行功能富集分析，以更加直观的发现衰老对不同细胞类型的共同影响。以下为示例图：

4、细胞互作分析

基于CellChat分析探究了细胞间的相互作用，结果表明细胞互作强度随着衰老而减弱：年轻组>老年组1>老年组2。其中，激活素信号可能有助于调节SSC的自我更新和分化。此外，支持细胞(配体)和分化的精原细胞(受体)之间的KIT信号通路减少，这一通路也已知在维持SSCs自我更新和分化的平衡中发挥关键作用。此外，与免疫系统相关的信号通路在衰老过程中也发生了变化，包括老年组巨噬细胞中MIF信号通路的减少和补体信号通路的增加。这些结果表明，睾丸体细胞信号在衰老过程中发生了对生殖细胞发育不利的变化。以下为示例图：

5、拟时分析

针对支持细胞在衰老过程中的变化，通过拟时序分析探究支持细胞在不同年龄组的轨迹分布。并结合拟时序和差异分析，对分化节点的一些调控细胞变化的关键基因再通过GO添加功能注释寻找相关通路。如下图所示：

6、GO功能富集分析

同样的方法探究间质细胞特异表达的基因及功能通路。这表明老年间质细胞总睾酮产量的下降更有可能与间质细胞数量的减少有关，而不是单个间质细胞睾酮产量的不足。其它类型细胞在衰老过程中的变化；同样的分析（差异分析，功能富集分析，免疫荧光实验）分别对管周细胞（TPCs），内皮细胞和巨噬细胞又来一遍。如下图所示：