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三代测序平台PacBio Sequel的平均读长为8-12Kb，16S rDNA长度大约为1500bp左右，该平台可以成功测序获得16S/18S/ITS的全长序列，获得全部变异区域序列信息，不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而能更加真实的还原样本中微生物的群落结构。三代扩增子测序技术不必挑选部分高变区，也不存在引物选择带来的结果偏差，能够获得更精准的物种分类，还可以获得更可靠的实验重复性和更稳定的结果。

样本要求

• 拭子＞5个

• 瘤胃液/发酵液/组织液/冲洗液（离心有明显沉淀）3-5mL，1g沉淀

• 粪便/肠道内容物  5g

• 动物/人组织  1g

• 土壤/污泥/沉积物/腐殖质  10g

• 水体滤膜  3张

• 空气滤膜  3张

测序策略

• 测序平台：PacBio SMRT

• 测序量：5000/10000CCS

高通量--能同时分析群落中所有的微生物

高数据质量--采用PacBio的CCS模式，对序列自我矫正，数据一致性准确率高

高分辨率--分析16 S rDNA全长，分类精准到种

高灵敏度--比单个高变区能够提供更多更精准物种信息

农业：根际微生物与植物的互作关系、农业耕作、施肥处理与土壤微生物群落等

工业：发酵过程中微生物群落和功能发生的变化

畜牧业：不同营养状态或免疫水平下微生物物种和功能差异

医学：菌群的组成、功能与疾病之间的关系

环境治理：环境治理过程中，微生态的变化

生物能源：可再生生物资源里微生物组成及功能

英文题目：MiDAS 4: A global catalogue of full-length 16S rRNA gene sequences and taxonomy for studies of bacterial communities in wastewater treatment plants

译名：MiDAS 4：用于污水处理厂细菌群落研究的16S rRNA基因全长序列和分类学的全球目录

期刊：Nature communications

影响因子：17.694

摘要：

微生物群落负责生物废水的处理，但对其多样性和功能的知识仍然很差。在这里，对来自全球740家污水处理厂（污水）的500多万个高质量的16S rRNA基因序列进行了测序，并利用这些序列构建了“MiDAS 4”数据库。MiDAS 4是一个扩增子序列变异解析，全长16S rRNA基因参考数据库，具有对所有序列从结构域到物种水平的全面分类。研究者使用一个独立的数据集（269个污水处理厂）表明：与常用的通用参考数据库相比，MiDAS 4为WWTP细菌提供了更好的覆盖率，提高了属和种级分类率。利用MiDAS 4，并利用两组常见的引物靶向16S rRNA基因的区域，对活性污泥植物进行了基于扩增的、全球规模的微生物群落分析，揭示了环境条件和生物地理学如何塑造活性污泥微生物群。同时还鉴定了核心类群和条件稀有或丰富类群，包括966属和1530种，分别约占累积读丰度的80%和50%。最后，发现对于经过充分研究的功能性协会，如硝化菌或多磷酸盐积累生物，相同的属在世界范围内普遍存在，每个属中只有少数丰富的物种。

图1 基于V1-V3和V4区16S rRNA基因扩增子数据的相对属丰度比较

图2 工艺和环境因素对活性污泥微生物群落结构的影响

图3 基于V1-V3扩增子数据鉴定核心和条件稀有或丰富类群