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细胞核中蛋白质介导的DNA空间互作具有重要的生理作用，相关研究成果经常出现在Cell Research、Nature Genetics、Nature Communications等知名学术期刊。以2022年部分成果为例，在扩张型心肌病、黑色素瘤、成人T细胞白血病、血管疾病和前列腺癌等疾病的表观遗传机制研究中，研究人员通常会关注H3K27ac等介导的空间互作，以获得顺式调控元件的高分辨率染色质互作loop，继而解析基因的表达调控。而在细胞发育和分化的研究中，研究人员也会以CTCF、SMC1等蛋白为目标分析相关DNA互作，从而剖析相应的染色质构象变化。
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部分蛋白质介导的DNA空间互作研究
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// 捕获蛋白质介导的DNA互作的方法
研究蛋白质介导的DNA空间互作，常规方法是联合Hi-C和CUT&Tag/ChIP-seq，其中Hi-C解析全基因组DNA空间互作，CUT&Tag/ChIP-seq识别蛋白结合的DNA位点，结合起来即可间接推测出目标蛋白介导的DNA空间互作。进阶方法是“双剑”合并，利用囊括两种信息的一种技术，例如ChIA-PET、HiChIP、PLAC-seq和HiCuT，一次性获得目标“peaks+interactions”信息。
在上述方法中，HiCuT（Hi-C Coupled chromatin cleavage and Tagmentation）是将Hi-C 3.0策略和CUT&Tag联合用于获得蛋白介导的DNA空间互作信息的创新技术。研究表明，在同类型技术之中，HiCuT相对缩短了实验时间，减少了细胞需求量，并且大幅降低了测序量要求。
捕获蛋白质介导的DNA互作的方法比较
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// HiCuT实验
在HiCuT实验中，首先参考Hi-C 3.0策略，对样本进行双交联、双酶切、补平和连接。
对样本进行交联时，使用可以交联到不同空间距离的两种试剂，相对单交联而言，双交联可以固定更多的互作；
裂解细胞后，使用两种四碱基酶进行酶切，双交联和双酶切处理能兼顾获得近距离和远距离的空间互作；
酶切后将黏性末端补为平末端，不添加生物素可以获得更多的DNA满足上机测序并降低PCR冗余；
利用DNA连接酶连接平末端，生成嵌合DNA片段。
之后则按照CUT&Tag步骤进行后续实验，包括ConA beads结合细胞、孵育一抗、二抗、pA/G-Tn5融合蛋白、转座、解交联、回收DNA并扩增，构建完成HiCuT文库。
HiCuT实验步骤
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// HiCuT数据分析
由于采用了Hi-C和CUT&Tag实验策略，因此HiCuT数据质控会同时关注顺反互作及不同距离的顺式互作比例、TSS富集效果、Peaks数量等。数据分析中，分析蛋白介导的DNA互作，重点是关注anchor两端均有peak的loop。首先通过将anchor上的peak注释到相应promoter上，将loop进行分类，包括promoter-promoter和promoter-other等loop，获得调控元件参与的互作。然后对相关基因进行GO/KEGG富集分析，研究基因参与的功能，还可以对loop上的peak序列进行Motif扫描及富集分析，鉴定潜在的参与互作的转录因子等调控蛋白。
HiCuT数据分析内容
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// 永利集团3044HiCuT项目经验
如下图所示，在组蛋白（H3K4me3）和染色质结构蛋白（CTCF）HiCuT实验的蛋白介导互作reads中，永利集团3044的HiCuT实验数据与文章的结果不相上下，并且在某些数据上，例如距离不短于20kb的顺式互作比例，永利集团3044的结果表现得更好。
对CTCF和H3K4me3 相关peak和loop进行可视化，“peaks+interactions”均一目了然。
永利集团3044HiCuT (CTCF、H3K4me3)的peak及loop互作可视化
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// 常见Q&A
选择HiCuT实验的一抗时有什么需要注意的要点呢？
答：为了达到好的富集效果，一抗是HiCuT实验的关键，建议选择被ChIP及IF实验验证可用且引用文献较多的抗体。
小 结
作为Hi-C和CUT&Tag技术的合体版，HiCuT技术相对于同类技术减少了对样本量的需求量，可获得高分辨率的空间互作，且极大降低了测序深度。使用HiCuT研究蛋白介导的DNA互作，联合ATAC-seq和RNA-seq，或GWAS风险位点等多组学信息，可以深入解析基因表达的表观调控机制。
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