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近日，期刊Arthritis Research & Therapy，发表了一篇题为“Multi-omics profling reveals potential alterations in rheumatoid arthritis with diferent disease activity levels”的研究论文。研究测量了具有不同疾病活动水平的RA患者的血浆代谢物、肠道细菌和真菌的变化。表明了血浆代谢物、肠道微生物群和类风湿关节炎疾病活动性之间的关系。研究通过多组学联合探索了疾病活动性变化的潜在机制，为提高RA的临床缓解率提供了一个有前途的治疗方向。

图1  文章发表信息

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性、全身性自身免疫性炎症性疾病，其发病机制尚不清楚。临床缓解，或减少疾病活动性，是治疗类风湿性关节炎的目的。然而，对疾病活动性的了解还不够，类风湿性关节炎的临床缓解率普遍较差。在这项研究中，研究人员使用了多组学联合分析的方法来研究具有不同疾病活动水平的类风湿性关节炎的潜在改变。

收集131例类风湿性关节炎（RA）患者和50名健康受试者的粪便和血浆样本，进行16S rRNA测序、内部转录间隔区（ITS）测序和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。同时收集PBMCS用于RNA测序和全外显子组测序（WES）。以28个关节和ESR（DAS28）为基础，分为DAS28L组、DAS28M组和DAS28H组。构建了3个随机森林模型，并使用93名受试者的外部验证队列进行了验证。

测序策略：16S rRNA测序+WES+ITS测序+LC-MS/MS

图2 实验流程图

（1）不同疾病活动水平RA患者血浆特征代谢物的变化

为了确定四组之间的差异代谢特征，对所有参与者的空腹血浆进行了非靶向代谢组学测序。在HMDB和Metlin数据库中注释了共281种代谢物（阳离子模式：133，阴离子模式：148）。根据OPLS-DA模型的投影（VIP）值的可变重要性和Wilcoxon检验的P值确定显着不同代谢物的选择VIP>1，p<0.05 被定义为显着不同的代谢物。L-苏氨酸、亚油酸、脱氧胆酸、二十二碳六烯酸、1,4-二羟基苯和L-色氨酸（A1-A6）与阴离子中的炎症生物标志物（CRP、ESR和IL-6）和DAS28评分呈负相关模式。它们在三个疾病组中的相对表达丰度下降。然而，D-半乳糖醛酸的情况正好相反。MG、1-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（OGPC）、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（18:0LYSO-PE）和甘油磷酸胆碱（GPC）（C5-C8）也与炎症生物标志物和DAS28评分呈负相关。它们在三个疾病组中的相对表达丰度下降。我们对差异代谢物进行了KEGG通路富集分析，以探索RA进展中代谢通路的变化。与HC组相比，疾病组代谢产物主要富集在甘油磷脂代谢和甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢途径上。同时，疾病组之间的差异代谢物在精氨酸生物合成和亚油酸代谢途径中富集。这些结果表明代谢途径在RA进展过程中发生变化，尤其是甘油磷脂和亚油酸途径，它们被定义为脂质代谢途径。

图3 具有不同疾病活动水平的RA的特征性血浆代谢物分析

（2）不同疾病活动水平RA患者肠道菌群组成的变化

通过16S rRNA和ITS测序检测所有受试者的肠道微生物组成后发现，在肠道细菌的门水平上，随着疾病活动度的增加，Firmicutes相对丰度比例逐渐降低，而Proteobacteria则相反。肠道真菌主要由子囊菌和担子菌组成。子囊菌在疾病组中富集，而担子菌在HC组中富集。在属水平上可视化细菌和真菌的物种组成，发现其他属也表现出不同程度的变化。病组真菌中念珠菌显着增多，但病组间无显着差异。青霉菌在疾病组中减少，尤其是在das28H组中。乳酸菌被认为是一种肠道益生菌，其相对丰度在疾病组中显着高于HC组，但在疾病组中逐渐降低。Escherichia-Shigella疾病组显着高于HC组，DAS28M、DAS28H组、HC组间有显着差异。还研究了肠道微生物多样性的变化。通过对四组ASV的Venn分析，DAS28L组肠道菌群多样性先降低后逐渐升高。对细菌扩增子测序数据PICRUSt2功能预测，结果显示亚油酸代谢途径在DAS28M和DAS28H组中显着增强。然而，甘油磷脂代谢途径和花生四烯酸（AA）代谢途径在疾病组中发生了变化，但没有显着差异。

图4 不同疾病活动水平的类风湿性关节炎之间肠道细菌和真菌的变化

（3）RA的转录组分析表明脂质代谢途径发生了变化

对来自大量具有不同疾病活动的RA患者的RNA-seq数据进行了测序，并使用主成分分析来证明这些疾病组是相似的。与HC组相比，不同疾病组的差异表达基因（DEGs）随着疾病活动度的增加而增加。同时，他们有162个共享的DEG，包括11个上调基因和151 个下调基因。与疾病活动相关的基因主要富集在与磷脂酰肌醇3-激酶信号传导相关的生物过程中。受影响最大的通路是趋化因子信号通路。类似地，通过GSEA分析，与趋化因子信号通路相关的基因在RA中显着上调。此外，我们还发现亚油酸代谢基因在RA中显着下调。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢也观察到相同的结果；甘油磷脂代谢；和花生四烯酸代谢作为亚油酸代谢。然后，为了证明脂质代谢途径在RA进展中的变化，进一步分析了三种脂质代谢途径的127个基因，发现了61个差异脂质代谢相关基因（LMRG）。其中，9个差异LMRGs与脂质代谢途径的差异代谢物相关（3个上调，6个下调）。与 DAS28L 组相比，PLA2G6Z 在DAS28M和DAS28H 组中显着降低。然而，随着疾病活动的增加， PTGS1逐渐增加。另一种 LMRG、GDE1，仅在DAS28H组中显着增加。 总体而言，转录数据分析表明脂质代谢途径在RA进展过程中发生了改变。

图5  RA的转录组分析表明脂质代谢途径发生了变化

（4）HLA-DRB1和HLA-DRB5基因位点的nsSNV与RA的疾病活动相关

研究者收集了20名健康受试者和33名RA患者的PMBC用于WES分析。共选择97个外显子突变率大于10%的nsSNV基因，对STRING与三个脂质代谢途径中的关键蛋白酶基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。最后，共有74个基因参与了脂质代谢的蛋白质相互作用网络。对这74个基因进行KEGG和GO富集分析表明，RA中富集了3个基因，即HLA-DRB1、HLA-DRB5和CCL3L3。根据上述6个疾病活动度基因突变率统计分析，HLA-DRB5 rs1071748突变率最高，三组突变率分别为40.0%（DAS28L）、53.8%（DAS28M），和60.0%（DAS28H）。同时，HLA-DRB1和HLA-DRB5的部分基因位点仅在DAS28M组和DAS28H组发生突变。同样，还发现DAS28L组中NCF1 rs201802880的突变率（20.0%）低于DAS28M组（53.8%）和DAS28H组（40.0%）。因此，假设 HLA-DRB1和HLA-DRB5基因位点的nsSNV可能与具有疾病活动性的RA相关。

图6  HLA-DRB1和HLA-DRB5基因位点的nsSNV与RA的疾病活动相关

（5）多组学分析揭示了肠道菌群、血浆代谢物、LMRG和外显子nsSNV与RA疾病活动之间的关系

富含甘油磷脂和亚油酸代谢途径的代谢物与RA疾病活动呈负相关。为进一步研究肠道微生物对脂代谢通路中疾病活动相关代谢物（MADAs）的影响，采用HC组与疾病组差异的细菌和真菌与疾病活动相关代谢物进行相关性分析。有28个真菌属和13个细菌属与 MADA显著相关，它们之间也存在相关性。使用RA转录数据来证明与脂质代谢相关的基因在RA进展中发生改变并与疾病活动相关。同时，nsSNV基因参与脂质代谢关键蛋白的相互作用网络。因此，推断血浆代谢物、肠道微生物和nsSNV共同构成了RA疾病活动的调节网络。

图7 多组学分析揭示了肠道微生物群、血浆代谢物、LMRG和外显子nsSNV与RA疾病活动之间的关系

（6）基于血浆代谢物和肠道菌群识别和预测具有不同疾病活动的类风湿性关节炎

利用随机森林算法对HC组和三个疾病组的差异代谢物、细菌和真菌选择特征参数进行分类模型构建，曲线下面积（AUC）值决定了HC组的重要特征参数个数模型。在DAS28L vs. HC、DAS28M vs. DAS28L、DAS28H vs. DAS28M这三个模型中，根据AUC值分别选取重要性排名前5、4、5的特征参数构建模型。对发现队列中的三个模型进行ROC分析，其AUC值分别为0.987（0.942，1.000）、0.769（0.440，0.994）和0.790（0.700，0.880）。同时，还包括了一个与发现队列具有相同标准的外部验证队列。最后，三个模型通过外部验证队列进行验证，其 AUC 值分别为1.000（1.000，1.000）、0.689（0.531，0.847）和 0.682（0.534，0.829）。

图8 RA 疾病活动的诊断结果由接受者操作特征曲线 (ROC)