近期，密歇根大学的研究团队在期刊aging cell（IF：11.005）中以“Three-dimensional chromatin re-organization during muscle stem cell aging”为题发表研究成果[2]。本文对年轻和老年鼠肌肉中分离出的肌肉干细胞进行了多组学实验。通过将Hi-C和RNA-Seq、与启动子相关的染色质修饰（H3K4me3）和ATAC-seq联合，研究观察到compartment水平的染色质结构较为稳定，TAD和染色质loop中则发生动态重组并关联着与细胞周期调节、维持静止和细胞应激相关的基因。为了提高分辨率，该研究还生成了成年和衰老期MuSC的单细胞ATAC-Seq并整合单细胞RNA-Seq数据进行分析。这种方法揭示了染色质中心内广泛变化的增强子-启动子互作，并且这与基因表达的改变有关。这项工作提供了一个丰富的多组学框架，深入探讨了对老龄化病理基因表达程序的调节机制。
研究思路
研究材料：成年期和衰老期小鼠的后肢肌肉
组学数据：Hi-C、RNA-seq、ChIP-seq数据、ATAC-seq数据、scATAC-seq、scRNA-seq数据
研究结果
肌肉干细胞衰老进程的全局三维基因组结构
该研究从成年期（3个月）和衰老期（24-26个月）小鼠中分离出后肢肌肉，并通过流式细胞荧光分选技术（FACS）得到肌肉干细胞（MuSC）。然后通过Hi-C对MuSC进行全基因组染色质相互作用分析。包括基于Juicer处理互作数据，并在JuiceBox中以5 kb的分辨率绘制TAD和loop等染色质结构。
100kb分辨率下，该研究通过Pearson相关矩阵的第一个特征向量，将互作图以~1M大小分割为与常染色质（A）和异染色质（B）相关的区域（compartment）。从成年期到衰老期，该研究发现MuSCs中A/B compartment的转变极少，并且静态A compartment的开放性变得更高。随后结合两个时期MuSCs的RNA-seq数据在静态A/B compartment的注释结果，该研究确认，随着年龄的增长，MuSC表达的变化可能是通过改变开放染色质区间（A compartment）的局部相互作用，而不是通过全局染色质结构的可塑性来实现的。
图1.MuSC从成年到衰老期compartment变化及对应染色质特征
通过HiCExplorer，研究人员以40kb分辨率在标准化互作矩阵表征TAD。 进一步分析ATAC-seq和H3K4me3信号（启动子相关信号），发现它们在TAD区域的富集特征与A compartment有关。随着年龄的增长，小鼠开放染色质区间内的TAD发生了广泛的重构，并且变化的TAD边界相对于稳定边界减弱了隔离强度和基因表达。新获得TAD边界的位置与附近基因启动子的距离变远，稳定边界和减少边界的位点则不然。因此在老化过程中TAD区域内为调控互作提供更多的空间而发生了重构。
TAD内连接性（Intra-TAD Connectivity，即intra-TAD/（Intra-TAD+Inter-TAD)）可以用来衡量TAD内相互作用的强度。经分析发现，TAD内连接性与激活的染色质特征正相关，且随着年龄的增长而增加，增加的TAD内连接性也与成年期增加的基因表达密切相关，但在衰老期关联下降，例如，内部连接性很强的TAD内包含与细胞周期调节（Anapc1/4、Cdc25a、Mcm6、Prim2）和脂质代谢（Acly、Ipmk、Sgms2、Aasdh、Pik3c3、Pi4k2b）相关的基因，但在成年期中基因表达上调。因此，局部染色质结构在MuSC老化过程中发生改变。即衰老期MuSC中TAD以更强的方式自我相互作用并改变TAD边界，但染色质折叠组织较少，无法驱动基因表达的协调变化。
图2.成年期和衰老期TAD内连接性与基因表达的相关性
通过HiCCUPS，该研究在成年和衰老MuSC中分别检测到3478和2877个loop结构。APA（Aggregate peak analysis）结果表明loop的识别结果准确，并显示不同时期存在类似的平均互作强度。约90%的loop在老化过程中仅存在于单个的TAD内。进一步分析静态A compartment中稳定loop和随着年龄增长而丢失的loop关联的基因，证实染色质loop与静止状态维持之间存在联系。随后通过TOBIAS分析转录因子足迹（TF footprinting），发现成年期的loop锚点富含Notch相关TF、Krüppel样因子(Klf)和特异性因子(Sp)家族的多个成员，这些因子有助于维持静止状态、染色质结构和增殖的调控。衰老期loop锚点则富集着CTCF、Zic4以及调节昼夜节律的TF(Nr1d1/2、Rora/c、Dbp)，这些因子同步调控关键的MuSC稳态途径，例如自噬响应细胞应激(Benitah和Welz，2020)。结果表明衰老期MuSC失去了与静止维持和细胞应激相关的染色质loop和TF结合位点。
图3.随着年龄增长，染色质loop形成不同的基因调控单元
2
单细胞多组学显示染色质hub在衰老过程中
发生变化
启动子-增强子互作存在显著的细胞异质性。该研究收集成年和衰老期小鼠后肢肌肉的细胞进行单细胞ATAC-seq，并对数据进行降维、整合和聚类。随后，该研究通过联合基因表达活性以及已有的单细胞RNA-seq和Tabula Muris Senis数据进行注释，结果与其他单细胞骨骼肌图谱类似且每类细胞有不同的开放位点，例如，与其他类型的细胞相比，MuSC中细胞尤其富集Pax7和Sdc4基因活性和基因表达。
图4.联合标记方法的识别结果
该研究在scATAC-seq数据通过MACS2 call peaks、将MuSC单独聚类，并联系基因远端位点的染色质开放性变化与局部基因表达差异鉴定特异性基因调控网络，在MuSC中识别到65536个具有正调节作用的peak-基因，代表潜在的增强子-基因相互作用。并且所有peak-基因主要位于单个TAD内。peak-基因的k-means聚类显示，成年和衰老MuSC之间具有明显的顺式调控互作，且注释后发现了在静态Acompartment中观察到的分子过程。此外，成年和衰老MuSC在调节RNA平衡方面存在差异，即mRNA剪接在成年MuSC中特异性富集，mRNA衰变在衰老期MuSC中显著存在，后者调节肌源性基因的表达，并与衰老表型有关。
图5.成年和衰老MuSC中的特异性基因调控网络
接下来，调查成年和衰老期MuSC之间的转录差异是否可以通过与顺式调控网络的连接性差异来解释。该研究通过Cicero确定远端调控元件和启动子之间的顺式共同开放性（cis-co-accessibility）模式，分别在成年期和衰老期确认了39038和39984对共同开放的位点，并且这样成对的共开放性位点更倾向于在一个TAD内。在peak-基因中，约60%的位点是都开放的，再次确认peak-基因是空间上不同网络的一部分。例如KLF2，它是肌肉融合的调节因子，在成年MuSC中明显上调，并且具有不同程度的染色质loop锚点，具有共开放模式的差异，突出了顺式调控网络的变化能驱动不同的基因表达。
图6.KLF2的顺式调控网络的变化
为了识别共同调节的染色质hub，将共开放的位点聚集到顺式共开放性网络 (cis-co-accessibility networks，CCAN) 中，该研究分别在成年和衰老期MuSC中生成1746和1965个 CCAN。 CCAN主要位于单个loop和单个TAD中。应用最大加权二分匹配算法在老化过程中识别出1173对稳定的CCAN。这些CCAN占所有可共开放位点的85%以上，并包含约50%的差异表达基因。此外，CCAN在成年和衰老的MuSC之间仅共享其组成位点的40.3%，并且这些网络中的差异基因表达在成年样本中相对显著上调。可见，在衰老过程中染色质Hub内启动子和远端调控元件之间的连接发生广泛改变，从而导致功能基因表达发生变化。 这些互作网络的变化主要发生在单个TAD中。
图7.CCAN主要位于单个loop和单个TAD中
小 结
该研究通过生成成年和衰老期期肌肉干细胞的三维染色质图谱，并将其与群体和单细胞的多组学（染色质开放性和转录组）概况结合起来，观察到衰老过程中肌肉干细胞在更精细的尺度（TAD和loop）上的局部互作重构和转录因子结合情况变化和异常基因表达的变化有关。该研究为老化过程的肌肉干细胞调节机制提供了新的见解。
参考文献：
1.Yang J H, Hayano M, Griffin P T, et al. Loss of epigenetic information as a cause of mammalian aging[J]. Cell, 2023.
2.Yang B A, Larouche J A, Sabin K M, et al. Three-dimensional chromatin re-organization during muscle stem cell aging[J]. bioRxiv, 2022: 2022.09. 21.508601.
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