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关于科学家最爱的工具之一: 扩增子测序技术。近期，小编发现好多小伙伴在进行扩增子测序时会遇见样本制备、样本设置、PCR扩增相关实验以及生信分析等问题。在此，小编归纳汇总了广受关注的扩增子测序相常见问题，希望能给大家作为一个实用的绕坑指南~~

Q1

土壤样品制备注意事项？

开始采样，去除表面浮土，使用乙醇火烧的铲子挖取地下5至20cm的土层，去除可见根后，土壤过2mm筛网，每个样品从3个采样点采集并混合而成，其中样品量为50g，将采集的土壤样品保存于无菌离心管中，置于 0°C以下，待样品采集完毕后，运回实验室，用于抽提 DNA，如不能马上实验，请将土壤样品迅速冻存于-20°C冰箱。

Q2

粪便样品制备注意事项？

粪便样品的保存，可放在-80℃，根据经验，取内部粪便提取基因组最好，但是不好操作。粪便冻上时候没有味道，但是一旦融化，味道会非常大，建议收集一部分就提取直接保存DNA。

Q3

对样品总量浓度的要求？

（1）样品类型：DNA或PCR产物；

（2）样品浓度：DNA≥10 ng/μL；PCR产物≥50 ng/μL ;（全长扩增子）；

（3）总量：DNA≥200 ng；PCR产物≥600 ng;（全长扩增子）；

（4）其他要求：

• 条带要求：条带单一，确保PCR产物无降解，无引物二聚体；

• 注意事项：建议客户自混样；

• 需客户提供电泳图，送样时请使用干冰或冰袋运送。

Q4

样品浓度检测？

采用的是Qubit，准确定量的检测DNA浓度。

Q5

样本降解的可能原因？

样本本身保存或取样位置导致降解；裂解时间过长、操作过慢导致降解；核酸保存方式不佳导致降解等。

Q6

DNA样品纯化（RNA消化）条件？

实验的消化条件为：取原液3 μL +6 μL ddH2O+1 μL RNase A（原浓度10 mg/mL），37℃，15 min。取2 μL进行电泳。

Q7

GC过低或过高对PCR的影响

DNA的AT含量高，热力学稳定性低，序列的重复性。会导致聚合酶无法复制，或引入错误。高的GC含量，带来了高的热稳定性。在PCR扩增的过程中，高GC的模板难以完全变性，即使变性，当退火步骤温度降低时，这些链也可能形成很强的分子内氢键，从而使聚合酶难以发挥作用。

Q8

文库的插入片段长度是什么意思？

不应该是一个长度范围么？

文库的插入片段是指被测序的DNA片段的长度。meta样品是将长的DNA片段用超声波等物理方法打断成目标片段长度，比如300 bp。严格来说，插入片段长度是一个范围，片段长度指DNA预期被打断的长度，或者打断后片段长度的中值。