PBMCs是外周血单个核细胞，采样便捷，实验简单，是单细胞实验的重要样本来源之一。目前，有大量基于PBMC的单细胞文献发表。简而言之，PBMC主要的细胞成分是免疫细胞，因此凡是与免疫相关的疾病，都可以采用PBMC进行单细胞测序，或同时进行单细胞BCR/ TCR测序，研究B/T细胞的克隆型状态。随着研究的深入，很多疾病都证明与免疫有着或多或少、或明或暗的关联；同时，PBMC也是机体的循环系统，可以反应机体总体或者局部的生理状态。因此，采用PBMC样本进行单细胞测序，对多种疾病具有广泛的普适性。
01
PBMC单细胞图谱
目前，关于PBMC的单细胞研究已经有大量的文献报道，因此PBMC的细胞和基因表达图谱已比较明确。PBMC里面的主要细胞类型包括T细胞（CD3D+，CD3G+），NK细胞（NKG7high，GNLY+，CD3-），单核细胞（Monocytes，CD14+，CD68+，LYZ+），DC细胞（CD68+，CD14-，MA4A7+，HLAhigh）和B细胞（MS4A1+, CD79A+, BANK1+）等免疫细胞，以及血小板（Platelets, PPBP+）等非免疫细胞。
其中， T细胞的丰度最高，并可以进一步分为αβT和γδT，后者为一种非典型T细胞，在PBMC-T细胞的占比一般低于5%。αβT可以进一步分为CD4+和CD8+ T两类，CD8+一般可以继续分为naive T，effect T，memory T等亚型，而CD4+则可以分为naive T，effect T，memory T，以及Treg和Th等亚型；此外，MAIT、NKT等一些非典型的T细胞也属于αβT。NK细胞则主要根据CD56和CD16两个marker区分，CD56+的NK一般命名CD56bright NK，表现为幼稚或者不成熟的NK特征，而CD16+的NK则可以命名为CD56dim NK，占血液中NK的绝大部分，由CD56bright转化而来；CD56dim NK又可以根据分化程度或者细胞状态分为若干亚型。单核细胞则可以根据CD14+和CD16+分为2大类，CD16+ Mono占比很低，而CD14+ Mono占比高，可以继续细分为不同的亚型。DC细胞可以分为cDCs和pDCs（SERPINF1+）, cDCs在分群上与Mono细胞比较靠近，但是cDC一般不表达CD14，但高表达HLA相关基因，可以籍此区分。B细胞一般分为Native B cells, Memory B cells和Plasma cells（MZB1+）等亚型。
02
案例解析
PBMC在单细胞研究中的角色一般有两个方面：（1）作为直接的病灶部位，比较疾病组和正常组；或者疾病不同亚型之间的区别；这种一般适用于感染性疾病、自身免疫性疾病、衰老、神经系统疾病等研究；（2）做为病灶的对照样本，这种情况一般是在健康的对照部位难以获取或者PBMC与病灶之间有某种关联的情况下，如肿瘤、复杂疾病等。当然，这两种角色并没有严格的界限，往往相互交织，彼此共存。
1、感染性疾病
一项基于75个对照样本和73个新冠患者（9个中等，64个严重患者）队列的PBMC样本的单细胞RNA+BCR+TCR测序，以及配对的基因组学测序研究发表于Nature Genetics上（图1），该研究发现新冠患者的非典型单核细胞（ncMono）细胞比例下降，可能是由于从典型单核(cMono)到ncMono的转化下降，并伴随着ncMono的趋化因子CXCL10表达降低及noMono与其他细胞的互作减弱。此外，还发现COVID-19体内浆细胞的BCR扩增明显增强；同时，基于GWAS发现的新冠易感基因在ncMono和DC细胞中的表达具有细胞类型的特异性1。
图1. 新冠PBMC单细胞研究
2、衰老
衰老是一种与机体衰退和死亡关系密切的生理状态，也是生命科学重要的研究课题。一项基于28-77岁不同年龄个体的队列的PBMC单细胞RNA测序数据（SE，17例），结合中国年轻队列（CYCT，5例），武汉队列（WHTCT，5例），日本老年队列（JOCT，5例）和超百岁老年队列（SC，5例）等已经发表PBMC的公共数据，构建了单细胞水平的衰老时钟并评估了SC的生物学年龄（图2）。基于衰老时钟轨迹模型推断，SC样本表现出Naive CD8+ T细胞比例升高，Cytotoxic CD8+ T细胞，Memory CD4+ T细胞和巨核细胞比例降低；同时研究还发现SC体内在更多的细胞和细胞类型上表现出更高水平的核糖体基因的表达，这可能有利于mRNA翻译过程，并与SC体内更低的炎症反应和更年轻的生物学年龄相关2。
图2. 衰老的PBMC单细胞研究
3、复杂疾病
本研究对过敏性皮炎（AD，10例）和牛皮癣患者（PS，10例）采集皮肤组织和PBMC，并进行单细胞RNA+TCR测序（图3）。研究首先对皮肤组织和PBMC的数据单独进行细胞分群和鉴定，构建各自的单细胞图谱；随后对T细胞进行亚型分析，基于细胞丰度差异发现Th17/Tc17和Th2/Th22分别为PS和AD疾病特异性的细胞亚型，并分析了Th17/Tc17和Th2/Th22在基因表达及细胞通讯方面的差异。TCR分析表明PBMC中扩增型的TCR克隆型主要来自于CD8+ Tem，而皮肤组织中扩增型的TCR克隆型主要来自Th17/Tc17，表明PS患者的疾病特异性TCR克隆型在样本间更易共享3。同理，通过对贲门失弛缓症和健康样本采集贲门组织和配对的PBMC，通过单细胞RNA测序以及比较分析，鉴定到C1QC+的巨噬细胞和组织驻留T细胞是贲门组织中的疾病特异性细胞亚型4。
图3. 皮肤疾病的PBMC和皮肤组织的单细胞研究
4、神经系统疾病
神经系统疾病发病机制复杂，可能与遗传、免疫、感染等多种因素相关。目前，小胶质细胞等与神经系统疾病的关系已有较多的报道，表明中枢神经免疫在神经系统的发病中可能起着重要的作用，同时这种信号可能也会传递到外周免疫系统，因此PBMC也是研究神经系统疾病的重要载体。一项基于对帕金森疾病（PD）患者和健康对照样本的脑脊液（CSF）和PBMC样本的T单细胞研究（图4），通过构建T细胞亚型图谱，结果表明PD患者体内CD8+ T 比例较对照升高，而CD4+ T则降低；对TCR的克隆型多样性和克隆扩增比较发现2组之间有明显的差异，并基于PD样本间CDR3序列相似、PBMC和CSF共享的克隆型、HLA基因分型等信息，鉴定了若干PD特异的TCR序列以及TCR-多肽-MHC的对应关系。此外，也有一些单独以PBMC为研究对象，发现外周血的T细胞/B细胞/NK细胞/单核细胞等对老年痴呆（AD）/PD/家族性Tau病等神经系统疾病相关的报道5-8。
图4. PD患者的脑脊液和PBMC的单细胞RNA和TCR研究
5、肿瘤
鼻咽癌（NPC）的肿瘤微环境具有高度的异质性，并对治疗效果产生较大的影响，本研究采集10例NPC肿瘤和PBMC配对样本进行单细胞RNA和TCR测序，研究构建了包含了肿瘤浸润的CD8+ T细胞、Treg细胞、DC细胞，以及不同EBV病毒感染状态的恶性细胞等53种细胞亚型的单细胞图谱。拟时轨迹分析发现耗竭性CD8+ T细胞和免疫抑制性TNFRSF+的Treg细胞可能是分别从血液的CX3CR1+CD8+ T细胞和Naïve Treg趋化而来。同时，研究还发现LAMP3+ DCs、耗竭性CD8+ T细胞、Treg细胞和恶性细胞之间具有强烈的细胞间相互作用，这可能有利于肿瘤微环境内部的免疫抑制层形成9。
图5. 鼻咽癌患者的肿瘤部位和PBMC的单细胞研究
总 结
总之，PBMC样本在感染、衰老、自身免疫疾病、炎症、复杂疾病、神经系统疾病、肿瘤等多个方向均有重要的研究意义和价值。作为研究的对照样本，或者病灶本身，基于PBMC的单细胞研究均有助于发现疾病特异的细胞类型和疾病相关的通路和标记物，有利于理解疾病的发生发展机制，并为后续的干预治疗提供重要的参考依据。
参考文献：
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4. Liu, Z. Q. et al. A single-cell transcriptional landscape of immune cells shows disease-specific changes of T cell and macrophage populations in human achalasia. Nat Commun 14, 4685, doi:10.1038/s41467-023-39750-5 (2023).
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6. Xu, H. & Jia, J. Single-Cell RNA Sequencing of Peripheral Blood Reveals Immune Cell Signatures in Alzheimer's Disease. Front Immunol 12, 645666, doi:10.3389/fimmu.2021.645666 (2021).
7. Xiong, L. L. et al. Single-cell RNA sequencing reveals B cell-related molecular biomarkers for Alzheimer's disease. Exp Mol Med 53, 1888-1901, doi:10.1038/s12276-021-00714-8 (2021).
8. Qi, C. et al. Alzheimer's disease alters the transcriptomic profile of natural killer cells at single-cell resolution. Front Immunol 13, 1004885, doi:10.3389/fimmu.2022.1004885 (2022).
9. Liu, Y. et al. Tumour heterogeneity and intercellular networks of nasopharyngeal carcinoma at single cell resolution. Nat Commun 12, 741, doi:10.1038/s41467-021-21043-4 (2021).
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