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        样本的选择与采集作为研究开展的第一步，尤为重要。取样方法与处理方式对后续研究结果会造成重要影响，今天永利集团3044为大家准备了土壤微生物研究取样方法及运输建议，希望对大家实验有所帮助。

1、准备工作

（1）制定采样计划

        采样计划包括目的、地点、样点数、采样方法和步骤、后处理和分析项目等，采样前要准备一份根据研究目的而设定的采样报告表格，采样日期及时间，当时或临近取样前的天气状况（包括气温、降雨、湿度等），以及所有可能影响后续测试结果的其他因素。

（2）器具准备

        根据采样目的准备相应需要的器具，可能涉及到的器具如下：

        工具类：铁锹、铁铲、取土钻等。

        器材类：GPS、照相机、卷尺、比色卡、泡沫箱、冰袋、烧杯、量筒等。

        试剂类：纯水、盐酸溶液（1:3）、酒精（95% ）等。

        文具类：样品标签、采样记录表、铅笔、记号笔、资料夹等。

        安全防护用品：工作服、工作鞋、安全帽、药品箱等。

2、采样设计

        单点采样：每个样品只采一个点，根据物理性状测定要 求可分为原状土采样和扰动土采样；

        混合样品采样：每个样品是由若干个相邻样点的样品混合而成，样点数目需要根据实际研究情况确定，一般只适于采集扰动型样品。为了保证所采样品的代表性，绝大多数试验要求采用多点混合采样。同一样方采取多点取样（建议4-5个取样点等量均匀混合为一个样本）；

        确定采样时间和频度：对于通量类观测，至少保证一个生长季，最好完整的一年。某些化学性质， 比如交换性阳离子、pH 、氮、活性炭，以及土壤生物库（微生物群落、土壤动物）会随着季节、植被物候、气象、样点状况而变化，可能的条件下应考虑数年中的通常状态，最好在这些比较稳定的时间采集。在合适的土壤水分状况时采集以方便筛分。避免长期干旱、冻害、洪水后立即采样。

3、普通土壤取样方法

        （1）根据研究目的确定采样范围，采样前应对采样工具及样品袋或取样管等进行灭菌处理，或用待采土壤样品擦拭；

        （2）建议运用点状取样法中常用的五点取样法采集土壤样品，即先确定对角线的中点作为中心抽样点，再在对角线上选择与中心点距离相等的点进行采样；或者运用等距取样法，由抽样的比率决定距离或间隔，如果老师想多采集一些生物学重复样本，建议用此方法；

        （3）去除表面浮土、凋落物等，使用经过处理的铁铲和小铲子挖取地下5~20cm的土层；

        （4）去除可见杂质后，根据土壤情况，选择是否过2mm筛网，每个样品从3个及以上采样点采集并混合而成，每5～10g分为一份；建议将样本分装3-5份备份；

        注：采样时需注意每个采样点的取土深度及采样量应均匀一致，土样上层与下层的比例要相同。

        （5）一个处理组建议取6个及以上样本，至少3个样本；

        （6）保存于无菌离心管中，置于泡沫箱或保温瓶（冰袋或干冰）中，0°C以下运回实验室；

        （7）如果条件不允许立即抽提DNA，可将样品置于-80°C冰箱中保存。并通过干冰寄送至公司后提取样品总 DNA。

4、根际土壤取样方法

        根际，是指受植物根系活动影响，在物理、化学和生物学性质上不同于土体的那部分微域环境。土壤微生物与植物之间相互关系需要对根际土进行取样研究。

        Bulk（编号B）：大田土（微生物）、非根际（微生物）。

        Rhizosphere（编号S）：根际（微生物），来自根际土。

        Rhizoplane（编号P）：根表（微生物），紧密附着根表面、部分来自根皮。

        Endosphere（编号E）：内生（微生物）。

        （1）采集植物植株，去除根周松散的土，仍附着在根系表面的视为根际土。将植物置于装有冰袋或干冰的保温箱中，避光条件，0℃以下运回实验室；

        （2）准备无菌容器，将植物根系部分置于缓冲液（PBS或生理盐水）中震荡，震荡时间和强度依据样本实际情况调整，洗下根际土；

        （3）将洗涤液进行高速离心（12000 g离心10 min），收集土壤沉淀，若沉淀较少，也可过0.22um滤膜，同一样方取样的样本进行多点等量混合；

        （4）将样本分装至离心管中，密封，标记样本信息后液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。

5、植物内生菌取样方法

        植物内生细菌是植物微生态系统中的重要组成部分，随着高通量测序技术发展，可直接对植物组织样本进行DNA提取，对特定区域扩增，对测序数据进行分析，进而研究植物内生细菌或真菌的多样性。

        （1）根据研究对象选取新鲜植物组织；0℃以下运回实验室；

        （2）将采集的根、茎等用流水冲洗，风干表面水分，根据组织大小剪成小块或小段，在无菌工作台内，用无菌水对植物组织进行漂洗两次；

        （3）第一次消毒：75%无水乙醇浸泡1min；第二次消毒：2%次氯酸钠处理3min，转入75%无水乙醇浸泡30s，接着用无菌水漂洗3次；

        （4）进行核酸提取实验或液氮速冻，放置-80℃冰箱保存。

总结

        （1）取样前对做好取样计划，准备好相关用具，记录环境信息，对采样工具进行消毒灭菌处理；

        （2）取样时建议分装3-5管进行备份，注意离心管密封好，标记样本信息；

        （3）取样时准备好置有冰袋或干冰的保温箱，低温运回实验室；

        （4）如不能立即提取DNA，可液氮速冻，放置-80℃冰箱保存;

        （5）避免保存时反复冻融，破坏土壤菌群结构。

永利集团3044样品送样建议

        宏基因组项目：土壤样本≥10g；DNA样本浓度≥50ng/μl；单次建库总量≥1μg（BGI/Illumina）或总量≥4μg(PacBio)；浓度以Qubit质检结果为准，建议送2次建库的量。OD 260/280在1.8-2.0之间；（菲沙可包提取）

        扩增子项目：土壤样本≥5g；DNA样本浓度≥5ng/μl（Illumina）或浓度≥10ng/μl（PacBio）；单次建库总量≥200ng；浓度以Qubit质检结果为准，建议送2次建库的量。OD260/280在1.8-2.0之间；(菲沙可包提取）

        永利集团3044拥有多种测序平台和强大的计算机资源，提供最佳的测序解决方案和快速的分析平台。可提供二代、三代扩增子和宏基因组测序服务。从样品提取、建库测序、数据分析、结果交付到售后服务为您提供一站式服务，为您助力高分文章。

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参考文献：

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2.Bulgarelli D, Rott M, Schlaeppi K, et al. Revealing structure and assembly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota[J]. Nature, 2013, 501(7468): S25.

3.ISO 10381-6: 2009 Soil quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory.

4.宋培勇, 李凤华, 马莉莉, et al. 珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析[J]. 微生物学通报, 38(1):8-13.

5.张甘霖, 龚子同. 2012. 土壤调查实验室分析方法. 北京: 科学出版社. 1-2.