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肥胖的发生受基因和环境因素的双重复杂影响，表观遗传因素作为基因变异和环境因素相互作用的重要纽带，其对肥胖风险的决定机制尚属活跃的研究领域。组蛋白修饰是一种常见的表观调控方式，其主要通过调节基因组的三维结构来调节基因的表达。其中组蛋白的甲基化修饰主要受甲基转移酶与去甲基化酶的影响。Kdm2a是一个催化H3K36me2去甲基化的组蛋白赖氨酸去甲基化酶，参与了许多生物学过程，如细胞增殖、分化、凋亡和肿瘤发生，但是它在肥胖中的作用研究得非常少，仍有待科学家们进一步探索。

近年来，免疫系统和代谢系统的高度相关性越来越明确，而肥胖的特征是脂肪组织的长期低水平的炎症。在较瘦的脂肪组织中，巨噬细胞主要为分泌扛炎症细胞因子的M2型，而在肥胖的脂肪组织中主要为促炎症的M1型。巨噬细胞的行为调节主要依赖于M1与M2型对于能量需求的差别。M1型主要依赖有氧糖降解产生ATP，而M2型依赖氧化反应，主要为脂肪酸氧化产生ATP。除此之外，表观调控因子通过调节相应基因的表达也在巨噬细胞的极化过程中起到重要作用。

本文通过构建Kdm2a缺陷型小鼠来研究Kdm2a在肥胖发生过程中的作用。结果表明，Kdm2a的缺失导致脂肪酸吸收的加快，启动了氧化代谢网络，使得M2型巨噬细胞增加，从而使得高脂肪饮食的小鼠免于肥胖。Kdm2a缺陷使得小鼠免于肥胖的机制为，Kdm2a缺失后，使得Pparg基因的H3K36me2 增强，开放性增加，招募更多的Stat6，启动巨噬细胞的M2极化。

01 肥胖的脂肪组织中巨噬细胞H3K36me2水平下降

研究团队首先对C57BL/6小鼠进行高脂饮食（HFD）和正常饮食（ND）喂养，分析两组小鼠的附睾白色脂肪组织(epWATs)和皮下白色脂肪组织（scWATs）中H3K36me2水平变化，发现HFD组小鼠的epWATs区别于scWAT，H3K36me2水平出现显著下降（图1A和1B），两组小鼠的epWATs中CD45⁺免疫细胞也表现出明显的H3K36me2水平下降（图1C）。脂肪组织巨噬细胞（ATM）是CD45⁺细胞的主要类型（图1E和1F），其H3K36me2水平在两组小鼠的scWAT都显著下降（图1G和1H）。研究人员进一步在人的样本中观察到类似的现象，肥胖患者的CD45+细胞的H3K36me2水平显著下降（图1I）。同时，CD68（人巨噬细胞标志物）和H3K36me2的免疫染色分析结果证实了人类ATMs中H3K36me2水平下降（图 1J）。综上，该研究表明肥胖患者的一大特征为ATMs的H3K36me2水平下降。

图1

02 kdm2a缺失促进M2型巨噬细胞增加

鉴于Kdm2a催化H3K36me2去甲基化，研究团队根据是否特异性在巨噬细胞中敲除了Kdm2a构建了KO组（Kdm2a^−/−）和WT组（Kdm2a^f/f）小鼠（图2A）。对两组小鼠的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）的Kdm2a和H3K36me2水平进行western blot分析，Kdm2a的缺失导致巨噬细胞内H3K36me2水平显著升高(图2B)。

为了找到Kdm2a的缺失对巨噬细胞极化的影响，研究团队分别用M1型巨噬细胞诱导剂（LPS）和M2型巨噬细胞诱导剂（ IL-4）处理8周大的KO组及其同窝鼠，发现Kdm2a缺失不影响BMDMs的产生和 M1型转化（图2C），Kdm2a^-/-  BMDMs 在LPS 诱导后Il6表达下调，M1相关基因如Il1b和Nos2没有改变(图2D)。与此同时，M2型巨噬细胞的一系列标志物如CD206⁺细胞、Arg1、Mrc1、Retnla等出现明显增加（图2E-2G），此外，KO组小鼠的腹腔巨噬细胞中M2型巨噬细胞总量在IL-4刺激后增加（图2H和2I）。在巨噬细胞的总量相当的前提下，相较于其同窝鼠，KO组中的epWAT组织中，有较多的M2巨噬细胞。综上，这些都论证了kdm2a缺失促进M2型巨噬细胞增加。

图2

03 Kdm2a缺失促进脂肪酸摄取和代谢重塑

为了深入了解Kdm2a调节M2型巨噬细胞增加的机制，研究团队进行对正常的BMDMs与KO组的BMDMs进行了RNA-seq测序。结果显示KO组具有558个上调基因和887个下调基因（图3A），同时，M2型相关的基因的RNA-seq 数据分析与RT-PCR分析结果一致，与脂质代谢相关的基因在KO细胞中显著上调(图3B和3C) ，相应的脂质代谢相关蛋白（ Pparg， CD36，Lpl和Plin3）表达量在IL-4刺激下的KO组小鼠中显著增加(图3D和3E)。上述的结果让研究者们猜想Kdm2a缺失导致的M2巨噬细胞增加可能是由于对代谢的重塑所致，故而作者进一步考察了脂肪酸的吸收和氧气的消耗。结果表明，KO组的脂肪酸摄取能力显著高于对照，氧气消耗明显高于WT组。综上表明，Kdm2a缺陷使得代谢重塑，有利于M2型巨噬细胞极化（图3F-3I）。

图3

04 小鼠巨噬细胞Kdm2a^-/-对高脂食物诱导的肥胖和胰岛素抵抗有保护作用

ATMs 在肥胖和胰岛素抵抗的发病机制中起着核心作用，因此研究团队使用高脂饮食喂养8周龄的KO小鼠和WT小鼠16周，结果显示KO组小鼠对于高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗有明显的保护作用（图4A-4J）。而在正常饮食下，KO组小鼠也表现出实质上更高的胰岛素敏感性，并且血浆和肝脏中的甘油三酯水平下降（4K和4L），肝内的脂质积累量减少（图4M和4N）。

图4

05 Kdm2a的缺失减少了脂肪组织中吞噬细胞的积累并抑制高脂饮食处理后脂肪组织的慢性炎症

高脂饮食引发肥胖的同时会带来炎症反应，然而研究团队发现，高脂饮食下，KO组小鼠中一系列炎性趋化因子水平呈降低状态（图5A-5C），并通过RT-PCR技术分析得知抗炎标记物的表达水平较高。同时，白色脂肪组织的免疫荧光染色结果显示，高脂饮食下KO组小鼠中巨噬细胞marker（F4/80⁺）数量减少(图5D和5E) ，流式细胞术也进一步证实了epWATs (图5F)和 scWATs 中总巨噬细胞积累减少(图5G)。此外，流式细胞分选结果还显示了KO组小鼠的epWATs和scWATs中M2型巨噬细胞的比例明显增高(图5H) ，WT组小鼠中M1型巨噬细胞的比例明显增高(图5J)。以上结果表明，Kdm2a的缺失情况下，高脂肪饮食诱导ATM总量减少，但是M2型细胞增加。

图5

06 Kdm2a^-/-促进能量消耗和脂肪组织褐变

关于Kdm2a^-/-在巨噬细胞中是否影响能量稳态，研究团队对小鼠进行了代谢指标分析。

高脂饮食下，KO组小鼠的呼吸交换率和食物摄入量明显高于对照组小鼠，正常饮食下则两组结果相当(图6A和6B))。其次，实时荧光定量 PCR 技术检测到了产热基因在褐色脂肪与scWAT中高表达（图6C-图6E）。

在低温4天的条件下，KO组小鼠的体温水平高于WT组，体重变化不明显（图6F和图6G），免疫印迹和RT-PCR分析结果一致，冷诱导后KO组小鼠Ucp1与TH基因表达上调(图6H和图6I)。此外，低温诱导的KO组小鼠的scWAT表现出明显的重塑，增加了米色脂肪细胞。可见Kdm2a缺失的巨噬细胞通过诱导脂肪褐变和增加米色脂肪提供了有利于产热的微环境（图J-图6M)。

图6

07 Kdm2a使Pparg基因位点的H3K36me2去甲基化，并减少招募Stat6到Pparg

ATAC-seq是研究染色质开放性的测序技术，研究团队采用该技术检测Kdm2a调控巨噬细胞极化的整体染色质可及性状态，结果显示，与WT组BMDMs相比，KO组BMDMs的转录起始位点（TSSs）附近的ATAC-seq平均信号增加（图7A和图7B），有1482个开放性增加区域（DARs），与944个开放性降低的DARs区域。研究团队考虑到Pparg在DEGs（差异表达基因）和DARs都属于上调，重点查看了Pparg位点在ATAC-seq峰的变化，确定Kdm2a^-/-导致Pparg基因在3个特定位点出现明显的开放性增加(图7C-图7F)。

染色质可及性增加和KO组BMDMs中Pparg转录本变化都与H3K36me2水平的变化有关。观察KO组和WT组BDMDs的H3K36me2富集水平，Kdm2a对Pparg DARs的H3K36me2富集水平具有负向调节作用（图7G）。细胞系中Kdm2a siRNAs实验也证实了在 Pparg DARs上 H3K36me2增强的富集水平（图7F）。接下来，研究团队评估了DARs中的转录因子。Stat6、c/EBPs和Gata3等相关转录因子在KO组小鼠的BMDMs的开放性显著增加区域显著富集(图7I)。与此相反，Klf5和 Hif1a 的结合位点在开放性显著降低区域富集(图7I)。ChIP-qPCR分析和ChIP数据表明，Kdm2a^-/-对于Stat6招募和Pparg DARs的M2型极化至关重要(图7J和图7K)。综上，Kdm2a的缺失促进了活性组蛋白甲基化标记H3K36me2以及招募Stat6到Pparg调控区域以重塑染色质的可及性。

图7

08 Kdm2a^-/-通过靶向pparγ协调巨噬细胞的选择性激活（M2型）

p-Stat6是M2型极化的必要因素，研究团队首先使用Stat6抑制剂以检测p-Stat6对KO组M2型极化的直接作用。Stat6抑制剂能有效地抑制WT组小鼠的Stat6发生磷酸化，消除WT组BMDMs的Arg1基因（M2型吞噬细胞marker）表达，但KO组中仍有较高水平的Arg1，表明对p-Stat6只是部分抑制了M2型巨噬细胞极化。然后，研究团队利用pparγ抑制剂研究pparγ（Stat6信号下游）在调节KO组小鼠的M2型巨噬细胞极化中的作用，结果显示添加了pparγ抑制剂的KO组小鼠的呼吸能力降低到了WT组相当的水平，western blotting结果也证实两组小鼠BMDMs的CD36表达、Arg1水平相当。综上，Kdm2a通过靶向pparγ影响巨噬细胞的选择性激活。

图8