2021年5月，华中农业大学金梅林教授团队在EBioMedicine杂志上发表了题为“Q493K and Q498H substitutions in Spike promote adaptation of SARS-CoV-2 in mice”的研究论文。研究发现了一个小鼠适应性新冠毒株WBP-1，并首次证明在SARS-CoV-2自适应突变的动态过程中，Q493K和Q498H突变在增强了WBP-1 的 RBD 与 mACE2 的结合亲和力。此外，通过体内和体外的实验，研究还初步发现，TLR7/8激动剂雷西莫德（以下简称R848）能够保护小鼠免受WBP-1感染。这为新冠病毒的研究和治疗提供了新的思路。永利集团3044在其中承担了文库构建和测序的工作。
实验材料：12个月的雌性野生型BALB/c小鼠、4-6周的雌性野生型BALB/c小鼠；
实验方法：在染病的11个世代的小鼠中，选择了P2、P5、P8和P11四个世代的小鼠各6只， 取肺组织进行RNA测序、组织病理学分析以及抗病毒的体内外实验分析。
实验结果
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对于小鼠适应性毒株WBP-1的不同世代的突变鉴定
血管紧张素转换酶2（以下简称ACE2）是新冠病毒（以下简称SARS-CoV-2）的功能受体，而模式动物小鼠对SARS-CoV-2感染的抗性来源于小鼠ACE2和SARS-CoV-2 spike蛋白受体结合域的不相容。为了揭示新冠病毒适应性的动态突变过程，研究通过对适应性新冠毒株WBP-1感染的不同世代小鼠肺组织样本进行高深度测序，发现WBP-1毒株相对于野生型新冠毒株Wuhan-Hu-1共发生了5个单碱基同义突变、5个单碱基非同义突变以及1个749bp缺失突变。缺失突变跨越了多个基因，包括ORF6、ORF7a、ORF7b和ORF8，5个非同义突变中的其中2个C23039A (Q493K) 和 A23056C (Q498H)位于spike蛋白受体结合域(RBD)（图1d）。在P2、P5、P8和P11四个世代中，P5代出现了21个突变，其中包含了3个稳定的突变（A8203G, 0.889; T17825C, 0.986; 和 A23056C, 1.000），同时可能介导病毒与小鼠ACE2结合亲和力的突变C23039A (Q493K)在该代开始出现。从P5到P8，有9个突变保存下来并新增了8个突变，P11代保留了来自P8代的13个突变。在P5、P8和P11的传代过程中新发的突变数量迅速减少，说明病毒基因组在宿主差异的选择压力下逐渐趋于稳定（图1e）。
图1 四个世代的适应性新冠毒株的变异展示
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小鼠适应性SARS-CoV-2 的发病机理
用连续稀释10倍的WBP-1（浓度为10⁵到10²PFU）感染小鼠并观察小鼠的体重下降和生存情况。从2天开始所有组的小鼠体重开始下降，在4天的时候浓度最低组小鼠体重下降并不显著为4.2%，浓度最高组小鼠体重下降超过20%（图2a）。幸存的小鼠在5天开始恢复体重，并在7天后恢复其原体重。而最高浓度组的5只小鼠在第五天全部死亡。进一步的mRNA测序发现感染后IL1β、TNFα、MCP1 和IL10的表达量有显著差异（图2e）。组织病理分析显示小鼠中的WBP-1复制的致病性特征，非常类似于许多人类COVID-19临床表现，包括发病率，死亡率和肺病理学（图2f,2g）。
图2 小鼠适应性SARS-CoV-2 WBP-1感染小鼠后的特征
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小鼠适应性WBP-1病毒通过小鼠ACE2进入细胞
为了验证是否WBP-1通过小鼠ACE2进入细胞，分别在野生型SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1和小鼠适应性SARS-CoV-2 WBP-1感染的赫拉细胞中转入表达人类的ACE2（hACE2）和小鼠的ACE2（mACE2）的质粒，并进行荧光染色，发现hACE2组中，Wuhan-Hu-1和WBP-1均可进入细胞并且完成复制，而在mACE2组中，仅WBP-1可进入细胞完成复制，说明WBP-1能够利用小鼠ACE2进入宿主细胞，而它感染人类细胞的能力也没有改变（图3）。
结构模型预测结果显示，携带Q493K/Q498H的WBP-1 RBD 对mACE2的结合亲和力和hACE2几乎相同（图4b），而Wuhan-Hu-1 RBD 和mACE2没有发生交互作用（图4c）。生物层干涉测量显示发生双突变Q493K/Q498H的WBP-1 RBD 对mACE2的结合亲和力相比野生型更强，但它们大大低于对hACE2的结合亲和力。
图3 小鼠适应性WBP-1病毒通过小鼠ACE2进入细胞荧光实验
图4 小鼠适应性WBP-1病毒增强了RBD与mACE2的结合亲和力
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R848在体内和体外对SARS-CoV-2的抑制
目前已经发现R848表现出对Wuhan-Hu-1的体外复制的剂量反应抑制，因此研究测试了是否R848在小鼠模型上也能表现出对WBP-1的抑制性。通过对感染WBP-1的小鼠注射R848,发现注射6天后注射组小鼠全部存活且恢复到健康体重，而未注射组小鼠则全部死亡（图5c）。组织病理学分析也证实了在R848治疗的小鼠中，炎症性肺的损伤和肺泡隔的增厚比治疗组的程度要轻（图5e）。同时也证明WBP-1病毒小鼠模型可以作为评估SARS-CoV-2治疗的平台。
图5 R848在体内和体外对SARS-CoV-2的抑制
小结
研究发现了一个小鼠适应性新冠毒株WBP-1，它在小鼠体内产生和人类由COVID-19感染引起的相同的病理和症状，可作为SARS-CoV-2具有严重疾病表型的小型动物模型，为评估新的抗病毒和疫苗策略提供宝贵的理论基础。此外，研究首次证明在SARS-CoV-2自适应突变的动态过程中，Q493K和Q498H突变在增强了WBP-1 的 RBD 与 mACE2 的结合亲和力，以及R848在体内和体外对WBP-1的抑制作用。
参考文献：
Huang K, Zhang Y, et al. Q493K and Q498H substitutions in Spike promote adaptation of SARS-CoV-2 in mice. EBioMedicine. 2021 May 13;67:103381. doi: 10.1016/j.ebiom.2021.103381. Epub ahead of print. PMID: 33993052; PMCID: PMC8118724.
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