动物胚胎、神经元、植物根尖、临床组织等样本常囿于来源稀少或材料珍贵等原因，难以获得其百万乃至十万级的细胞数，低起始细胞量的技术应用自然如火如荼。永利集团3044低起始量Hi-C、ATAC-seq、CUT&Tag表观产品也应运而生。
低起始量Hi-C
Hi-C技术能获得全基因组序列在空间中的互作信息，通常应用于基因组辅助组装和三维结构互作研究。原位Hi-C实验步骤包括甲醛交联（固定）、酶切、末端修复引入生物素标记、连接、解交联、DNA提取建库和高通量测序。整体反应体系较大，其中频繁的离心、洗涤和换管，以及较窄范围的DNA片段大小选择，对于二代测序阶段DNA量产生影响。因此，Hi-C技术对细胞起始量的要求较高，通常需要百万级别的细胞量，这对于胚胎发育、肿瘤和临床疾病等等研究有所限制。
2017年，基于原位Hi-C技术的两种低起始细胞量方法- Optimized low-input in situ Hi-C和sisHi-C[1-2]先后发表于Cell和Nature。2018年，Low input Hi-C[3]于Nature Communications上线。这些方法均类似于原位Hi-C的实验方法，通过缩放反应体系、减少实验步骤、减少转管次数来避免样品损失。细胞数量最低可至百个以下，可以对极珍贵的细胞类型进行研究。
案例分享
体细胞核移植（SCNT）可以将终末分化的体细胞的细胞核重编程为全能性状态。由于哺乳动物胚胎细胞数量和实验手段的限制，此过程的染色体三维结构的高分辨率的动态变化之前一直鲜为人知。
在“Analysis of genome architecture during SCNT reveals a role of cohesin in impeding minor ZGA”[1]一文中，研究团队采用低起始量Hi-C（sisHi-C），得到小鼠SCNT各个时期以及SCNT后胚胎的发育过程中的三维结构。研究发现，被移植的细胞核率先进入类有丝分裂状态，并且和正常受精的胚胎相比，SCNT胚胎在1细胞阶段具有较强的拓扑相关结构域（TAD），但2细胞阶段的TAD变得松散，之后慢慢整合。同时， A/B compartment在SCNT胚胎的1细胞阶段减弱，后期越来越强。 在8细胞阶段之前，SCNT胚胎细胞的染色质架构基本与正常受精胚胎结构基本一致。
激活前后体细胞核移植（SCNT）胚胎的Hi-C互作热图
永利集团3044紧跟市场需求，已完成多个低起始量Hi-C项目。近日，我们成功完成了3个低细胞量小鼠细胞的Hi-C，细胞数量仅600个，小测质控结果显示有效数据率高达75%以上，并对大测数据构建了Hi-C互作热图和识别TAD结构。
永利集团3044-600个小鼠细胞的单染色体Hi-C互作热图（左）和TAD识别（右）
低起始量ATAC-seq
2013年，美国斯坦福大学的研究人员开发了ATAC-seq，该技术使用高通量测序对Tn5转座酶易接近性染色质区域进行快速分析。相较于DNase-seq，该方法样本处理时间更短，且仅需500-50,000细胞。而后有研究团队通过优化裂解缓冲液和DNA纯化步骤，将细胞量进一步降低到两位数的水平（miniATAC-seq）[7]。
mini ATAC-seq vs. conventional ATAC-seq
案例分享
受精完成后，哺乳动物的胚胎早期发育过程发生有激烈的染色质重组。 由于人类胚胎的珍稀，该阶段的染色质景观及其分子动力学探究不易。 在“Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA”一文中，研究团队使用低起始建库量的miniATAC-seq，得到早期胚胎发育过程的染色质区域开放程度的高质量数据，并基于此找到人和小鼠早期胚胎，以及人多能态细胞之间保守和特异的调控规律。
不同细胞量的miniATAC-seq信号分布
此外，在人的合子基因组激活（ZGA）之前，CpG富集的启动子区域有广泛的开放性，大部分远端非启动子开放区域在ZGA之后变得不再开放，后者大部分区域与人卵母细胞中的DNA低甲基化结构域重叠并富含转录因子结合位点。
永利集团3044也已完成多个低起始量ATAC-seq项目，包括一些细胞含量很少的植物果实、根部组织等，以下展示我们项目的实测数据结果，效果相当好呢。
低起始量CUT&Tag
CUT&Tag技术于2019年被开发，凭借便捷的实验操作、更少的测序量、极低的背景噪音、以及适用于少量细胞等优势，一经问世便被追捧，大有取代ChIP-seq之势，其技术原理及优势详见“新品上市丨CUT&Tag革命性新武器，菲沙已为您配备”。对于起始细胞量的要求，CUT&Tag自带“低起始量光环”，作者指出针对组蛋白，可低至100个细胞；针对转录因子，可低至1000个细胞，而数据质量都很好且不同细胞起始量的结果也较稳定。
不同细胞量的K562-H3K27me3的CUT&Tag信号分布
永利集团3044拥有丰富的CUT&Tag建库测序分析经验，研究的物种和组织类型多样，包括人细胞、小鼠细胞、小鼠肝脏、果蝇胚胎、猪肝脏、鱼类组织、斑马鱼胚胎、羊肌肉，等等。目标蛋白包括组蛋白、结构蛋白CTCF、转录因子、标签融合蛋白，下图节选自永利集团3044的组蛋白或转录因子的CUT&Tag数据质控结果，效果也都相当好呢。
从以上结果来看，CUT&Tag的背景噪音非常低，富集效果均良好，且对低细胞量样本有很好的解决办法。
TIPS
最后，若您的细胞量低至<1000个细胞，其送样与常规细胞量项目有区别，原则在于避免样本损失，我们建议：
将细胞悬在10μL PBS中即可（使用低吸附的PCR管），液氮速冻干冰运输。
参考文献：
[1] Ke Y, Xu Y, Chen X, et al. 3D chromatin structures of mature gametes and structural reprogramming during mammalian embryogenesis[J]. Cell, 2017, 170(2): 367-381. e20.
[2] Du Z, Zheng H, Huang B, et al. Allelic reprogramming of 3D chromatin architecture during early mammalian development[J]. Nature, 2017, 547(7662): 232-235.
[3] Díaz N, Kruse K, Erdmann T, et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 1-13.
[4] Zhang K, Wu D Y, Zheng H, et al. Analysis of genome architecture during SCNT reveals a role of cohesin in impeding minor ZGA[J]. Molecular Cell, 2020, 79(2): 234-250. e9.
[5] Chen M, Zhu Q, Li C, et al. Chromatin architecture reorganization in murine somatic cell nuclear transfer embryos[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 1-14.
[6] Wang Y, Wang H, Zhang Y, et al. Reprogramming of meiotic chromatin architecture during spermatogenesis[J]. Molecular cell, 2019, 73(3): 547-561. e6.
[7] Wu J, Xu J, Liu B, et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA[J]. Nature, 2018, 557(7704): 256-260.
微信公众号
027-87224696
|
marketing@frasergen.com
|
