免疫组库是机体在某个时刻表达的全部的B细胞表面受体（BCR）和T细胞表面受体（TCR）的总和，与机体的免疫状态息息相关。目前，由于人和小鼠等物种的Ig和TR序列信息注释完全、引物设计成熟，免疫组库测序在人和小鼠物种中应用十分广泛。随着技术的进步，免疫组库在其他脊髓动物中的应用也逐步展开，本文综述了相关研究，以飨读者。
01
大鼠的免疫组库研究（10x单细胞）
本研究探究了基于单细胞BCR测序（scBCRseq）的高通量方法来获取全长配对BCR可变区域的可行性。研究一共从大鼠、小鼠和人的血液和淋巴结来源的250,000个B细胞进行测序、谱系和扩增分析。建库采用10x Genomics 5`端方式进行，其中，大鼠和小鼠的扩增引物为本研究定制引物，人为10x官方提供的商业引物。结果表明。scBCR-seq技术可以鉴定杂交瘤技术发现的81%（n = 56/69）的BCR谱系，同时，还鉴定了710个新的BCR谱系，且发现测序鉴定的99%（n = 92/93）的谱系具有抗原反应活性。本研究表明scBCR-seq是抗体发现的利器[1]。
图1. 两只大鼠的轻重链V基因配对情况统计
02
硬骨鱼的免疫组库研究（10x单细胞）
在人和小鼠等哺乳动物中，一个B细胞通常只表达一种类型的重链和一种类型的轻链，二者唯一匹配。但是，在鱼类等物种中，似乎不合乎该规律。本研究以三条虹鳟为研究对象，从其血液中分选MHC II+细胞，然后进行5`端的单细胞RNA和单细胞BCR建库测序，其中，BCR的引物为独特的两步法扩增引物（FW1区引物和恒定区引物）。结果表明，大量的虹鳟单个B细胞表达一种以上的重链转录本和一种以上的轻链转录本，即这种双链的多组合模式在虹鳟B细胞中普遍存在[2]。
图2. 鱼单个B细胞鉴定的多种轻链克隆型
03
猴子的免疫组库研究（二代+三代）
虽然付出了巨大的努力，但是全球HIV疫苗的研究仍然成效甚微。近来，一种基于渗透性迷你药泵技术的缓释接种方法相较于普通的疫苗表现出更好的疗效。为了探究相关的机制，研究人员以印度猕猴为研究对象，比较了传统的一次注射法和新的缓释注射法的BCR差异。为了克服猴子的Ig参考序列不全的困难，研究首先采用三代PacBio HiFi测序构建了完整的BCR V(D)J区域的参考序列集，然后采用二代Miseq平台进行BCR测序。结果表明两种免疫方法产生的特异性的BCR克隆谱系存在显著差异，同时，V基因区域的体细胞高频突变率也存在差异，并鉴定了差异使用的IGLV3-15*01基因。研究揭示了两组免疫方法的BCR状态的差别[3]。
图3. 传统组（Bolus）和缓释组（OP）的V基因突变率比较
04
猪的免疫组库研究（二代）
由于和人的基因序列高度同源，猪是重要的模式生物；同时，猪也是重要的经济物种，对感染性疾病的预防至关重要。因此，研究猪的免疫组库意义重大。本研究从猪外周血中分选普通的T细胞和iNKT细胞，采用3`端的特异引物和5`端的通用引物，进行TCR的扩增和建库测序（采用Illumina NextSeq 500平台）。分析首先采用组合信号序列（RSSs）来完善参考序列不全的缺陷，结果表明与传统T细胞不同，iNKT细胞在VJ基因使用上明显的偏好性，主要为pTRAV10, TRAJ18*01和pTRBV25基因[4]。
图4. iNKT细胞的VJ基因使用频率统计
总 结
免疫作为生物界的普遍生理功能，BCR和TCR的分子特征研究具有重要的意义。目前，除了人和小鼠等物种外，其余动物的免疫组库研究仍然比较局限。相信随着技术的发展，特别是PacBio HiFi三代长读长测序技术的应用，可以实现IG和TR的V(D)JC参考序列完整的构建和注释，进而实现高特异性扩增引物的设计和BCR、TCR序列的扩增和测序、分析，最终实现更多物种的免疫组库研究！
参考文献：
1.Goldstein L D, Chen Y J J, Wu J, et al. Massively parallel single-cell B-cell receptor sequencing enables rapid discovery of diverse antigen-reactive antibodies[J]. Communications biology, 2019, 2(1): 1-10.
2.Perdiguero P, Morel E, Díaz-Rosales P, et al. Individual B cells transcribe multiple rearranged immunoglobulin light chains in teleost fish[J]. Iscience, 2021: 102615.
3.Cirelli K M, Carnathan D G, Nogal B, et al. Slow delivery immunization enhances HIV neutralizing antibody and germinal center responses via modulation of immunodominance[J]. Cell, 2019, 177(5): 1153-1171. e28.
4.Yang G, Artiaga B L, Lomelino C L, et al. Next generation sequencing of the pig αβ TCR repertoire identifies the porcine invariant NKT cell receptor[J]. The Journal of Immunology, 2019, 202(7): 1981-1991.
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