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Aire调节因子通过驱动髓质胸腺上皮细胞 (mTEC) 中大量基因组的混杂表达来控制免疫耐受。它的分子机制仍然是个谜。

1、研究者取C57BL/6 Aire^+/+和C57BL/6 Aire^-/-两种基因型的同窝小鼠的mTEC进行体外Hi-C实验，每种基因型两个生物学重复，平均测序深度是~600M。Hi-C数据经过HiCCUPS得到150.4M互作和3069个loop，分析发现Aire对mTEC染色质的三维结构有很强的影响。

2、研究者比较突变体和WT mTEC的A compartment和B compartment分布，找到Aire诱导基因偏向于B-A compartment转换，随后在Aire存在或不存在的情况下对超级增强子和Aire靶基因进行了聚峰分析，发现Aire增强了超增强子和Aire诱导基因之间的相互作用并降低了超增强子和Aire中性基因之间的相互作用，因此Aire促进转录looping。

3、随后，研究者关注染色质构象协调元件（例如中介体、黏连蛋白和CTCF）与Aire的关系以了解Aire对超级增强子-启动子looping的影响。（1）分析已有的大量质谱（MS）数据找到和Aire免疫共沉淀的蛋白，检测到中介体（MED8）和黏连蛋白亚基（(SMC1、SMC3、RAD21），没找到CTCF；（2）生化实验（HEK293T细胞），检测到多个黏连蛋白组成（SMC1、SMC3、RAD21和SA-2）和中介体（MED1和MED12），没有CTCF；（3）ChIP-seq（Aire、MED1、SMC1和CTCF），四种峰主要主要定位于基因间、TSS和内含子区域且结果和前两种方法一致。因此，在mTEC中，Aire与中介体和黏连蛋白复合体有相互作用，但未检测到与CTCF的相互作用。

图1 Aire影响mTEC中的染色质结构，并促进超级增强子和Aire诱导基因之间的相互作用

4、从上面知道了Aire和蛋白复合体与转录looping有关，研究者通过ChIP-seq（H3K27ac）找超级增强子与其联系，发现Aire促进黏连蛋白和中介复合物在超增强子的富集且这与新发现的转录loops有关。

5、已知超级增强子通常位于黏连蛋白和CTCF分隔的更大染色质域内，loop数目和Aire有关且该研究已检测的主要是没有CTCF介导的loop，研究者假设Aire可能将CTCF逐出结构边界以影响染色质结构，并通过结合mTEC中CTCF的染色质位置以及Aire+和Aire- mTEC中ChIP-seq（CTCF）信号强度，确认了与猜想一致还伴随着CTCF-CTCF环减少，并利用HEK293T细胞的免疫共沉淀予以证实。

6、在4.5的结论下，研究者通过两种方法探究其潜在机制。

（1）首先是已发表的数据验证，ATAC-seq的深度分析CTCF印迹以及甲基化分析，都未找到Aire引起的差异。

（2）其次是测试Aire对调节DNA上黏连蛋白的分子的影响，包括有loader（NIPBL）和unloader（WAPL）元件，发现Aire不与WAPL相关而与NIPBL相互作用，它也增强了NIPBL与酶内黏连蛋白亚基的关联。

（3）随后，研究者在mTEC进行CUT&Tag（NIPBL），发现NIPBL优先定位于超级增强子，而且超增强子上的Aire和NIPBL信号之间有很强的相关性。因此Aire表达有利于超级增强子-启动子转录loop，而不利于相互作用域和TADs的结构loop。Aire-NIPBL之间的直接或间接的相互作用可能是这些变化的重要驱动因素。

图2 Aire与NIPBL相互作用，但不与WAPL相互作用，将黏连蛋白分布在超级增强子

7、最后，研究者想验证黏连蛋白对Aire诱导基因的重要性，于是以TEC中删掉编码SA-2的Stag2基因的小鼠为突变型，观察到这对小鼠胸腺组织形态无影响。而关于SA-2对转录本的影响，通过低起始RNA-seq比较野生型和突变型，结合Aire缺失引起的转录本变化，发现依赖于SA-2和依赖于Aire的基因转录本重叠度很高，故而在体外mTEC中验证了Aire和黏连蛋白的作用机制。

总之，该研究为了验证Aire促进超级增强子-启动子环影响染色质结构的假设，对来自表达Aire或不表达Aire的小鼠胸腺的体外mTEC进行全基因组的高分辨率Hi-C实验。 将所得数据与Aire的全基因组定位，中介体和黏连蛋白复合物组成以及CTCF的分布进行整合，确定支持loop模型，并且通过生化和体内功能丧失分析得到进一步验证。该机制模型解释了Aire对mTEC转录影响的许多不同寻常的特征，提供了阐释耐受诱导的分子视角。

在减数分裂期间，染色体在形态和核内位置方面表现出巨大的变化。 这些变化如何影响同源染色体配对、对齐和重组仍然难以捉摸。

1、研究者采用小鼠精子发生作为模型系统来研究哺乳动物减数分裂期间的染色体结构及其功能意义，特别是同源相互作用的调节。首先，研究者通过FCAS技术分离细胞并通过RNA-seq评估细胞纯度，然后利用Hi-C技术系统地绘制了小鼠精子发生过程中第一次减数分裂。（MⅠ）前和前期中各亚阶段（细线期，偶线期，粗线期，双线期）的三维基因组结构，得到共计200-500M大小的有效数据。

2、研究者基于染色质互作概率的幂律分布函数，表明沿染色体轴出现线性排列的染色体环阵列并确定染色体折叠模式的转换时间，而且MⅠ前期染色质环大小逐渐增加，原因可能是减数分裂黏连蛋白复合物驱动的挤压环过程。通过insulation-index方法分析TAD边界强度，结合CUT&Tag实验和已有的ChIP-seq数据找到CTCF分布，结果显示尽管CTCF在减数分裂期间大部分保留在染色体上，但其将染色质环锚定在特定位点并创建TAD边界的能力受损。并且，CTCF/REC8共定位位置评估显示CTCF/REC8位点可以作为挤压环的屏障却不是强屏障，可能引起减数分裂染色质环大小的异质性。

图3 小鼠精子发生的三维基因组结构

3、DNA双链断点（DSBs）在轴附着的染色质环之内并且促进同源比对，研究者分析对交换（crossovers，COs）有助与否的位点并检测它们周围的染色质结构，根据减数分裂Ⅰ期间的相互作用关系变化确定DSB位点周围高级染色质结构与成为CO或非CO的命运相关。

4、持续的转录活性作为减数分裂的一大特征，该研究基于同源比对发生时，减数分裂Ⅰ期间compartment变化和染色质环大小变化，联系每个基因组区间与其同源染色体上100kb范围内区域的总互作频率以及CO的形成，发现转录活性和非活性基因组区域分别由较短和较长染色质环组成的交替结构域形成，这与同源相互作用的模式和重组事件的分布相关。

5、在早期减数分裂前期，除了染色体内环结构的变化，进一步分析热图中的“alignment tracts”显示染色体之间末端对齐长度有相当大的范围（~20%），并且染色体末端的空间排列可能在减数分裂重组的调节中起作用，随后经由小鼠缺陷模型，证实细胞骨架和核骨架的连接（LINC）复合物可促进染色体末端的对齐，这种功能可能有助于同源突触和CO形成。

图4 在相当大的范围内染色体末端对齐需要端粒-LINC复合体关联

该研究揭示了转录和LINC对减数分裂染色体结构的影响，并表明染色体结构可能为高等真核生物减数分裂重组的调节奠定基础。