近日，西南民族大学化学与环境学院杨胜韬教授团队在Science of the Total Environment期刊发表了题为“Toxicity and activity inhibition of metal-organic framework MOF-199 to nitrogen-fixing bacteriumAzotobacter vinelandii”的研究论文，研究了MOF材料对固氮菌的环境毒性和影响，以MOF-199为主要研究对象，探究了其对固氮菌A.vinelandii的毒性和活性抑制作用，解析了其作用机制，为进一步了解MOF材料对固氮菌和固氮的环境危害和风险提供基础。永利集团3044承担本研究中的转录组测序、分析等工作。
研究背景
金属-有机框架材料（MOFs）是一种新型材料，具有制备简单、成本低等优点，在各个领域均有广泛的应用。但MOF材料的环境安全性还没有得到广泛的研究。已有研究表明MOF材料具有环境毒性，因此评价MOF材料对关键微生物的环境毒性迫在眉睫，本研究选取MOF代表材料MOF-199进行研究。固氮系统在生态平衡和农业发展中至关重要，其中生物固氮主要依赖固氮菌，但MOF对于固氮菌的生物效应还是个未知数，本研究选择具有代表性的固氮菌A.vinelandii进行研究。
技术路线
研究结果
1.MOF-199的表征
MOF-199是在吸附、分离、催化等方面应用方面研究最多的MOF材料之一。对所合成的MOF进行扫描电镜、XRD、红外光谱、拉曼光谱等验证，结果表明其表征与此前研究一致，说明MOF-199已成功合成，可用于后续的环境毒性检测。
图1 MOF-199表征数据
2.MOF-199对A. vinelandii的毒性
根据此前研究，设立不同浓度MOF-199暴露组。首先对A. vinelandii的生长曲线进行研究，发现当MOF-199达到40mg/L后，菌体生长会受到抑制；达到60mg/L时，完全抑制生长。再使用荧光染色对细胞存活率进行检测，当MOF-199浓度达到40mg/L后，存活率会出现下降；达到60mg/L后，细胞数量极少，以至无法统计存活率。这与此前报道的MOF-199抑菌作用相同。上述结果表明，40mg/L的MOF-199已经显著抑制A. vinelandii的生长。
图2 MOF-199对A. vinelandii的生长抑制作用
同时研究也发现MOF-199会导致A. vinelandii的超微结构改变，30mg/L的MOF-199会使细胞壁更粗糙。当浓度为50mg/L时，细胞壁上会出现孔洞，更多的颗粒物附着在细胞表面。同样透射电镜下也发现空白组细胞内充满了大量囊泡，在MOF-199浓度为30mg/L时，囊泡数量略有减少；浓度达到50mg/L时，囊泡数量进一步减少，并且观察到细胞壁和细胞膜的脱落。囊泡的现成有利于固氮，因此囊泡的减少说明MOF-199对A. vinelandii是有害的，并可能影响其固氮。值得注意的是，并未在胞内发现MOF-199。
图3 A. vinelandii的超微结构改变
3.MOF-199对固氮效果的影响
生物固氮是固氮菌的重要功能，我们采用乙炔还原法和同位素稀释法定量研究MOF-199对A. vinelandii固氮活性的影响。在暴露72h后，A. vinelandii的固氮活性下降。40mg/L和50mg/L的MOF-199均能抑制活性，60mg/L的MOF-199未检测到活性，两种方法结果相似。
固氮基因（nifH）是调控固氮生物的关键基因之一。该基因的正确表达可产生固氮酶参与固氮过程。经过MOF-199处理后，30 mg/L组对比对照组出现下降，50mg/L组显著降低。MOF-199降低nifH水平，会导致固氮酶减少从而影响固氮活性。此外ATP酶也是固氮过程中的关键。在暴露于MOF-199后，40~50mg/L浓度下，ATP酶活性显著下降，60mg/L浓度下，检测不到ATP酶活性，与其对应的细胞内ATP含量也呈现相同的降低趋势。
此外，通过转录组测序对差异表达基因的分析也支持MOF-199影响ATP酶的观点。通过对差异基因进行KEGG富集分析，其主要富集的结果表明MOF-199严重改变了氧化磷酸化过程。而氧化磷酸化则是细胞合成ATP的重要过程。由于MOF-199影响氧化磷酸化过程，MOF-199可能会抑制ATP合成，从而切断固氮的能量供应。
图4 MOF-199对A. vinelandii固氮活性的影响
4.MOF-199对A. vinelandii的毒理机制
氧化应激被认为是MOF-199的一般毒理学机制。研究观察到谷胱甘肽（GSH）呈剂量依赖性下降，丙二醛（MAD）呈上升趋势。30mg/L时，GSH对比对照组有明显降低，到60浓度时无法测出。相应的MDA出现升高。T-AOC水平在30mg/L或更高时下降。SOD水平在30mg/L达到最大值，40mg/L出现下降。这四个氧化胁迫指标表明。MOF-199会诱导氧化胁迫并介导氧化损伤。此前报道MOF毒性来源于其释放的Cu离子，通过IPS-MS证明了其会释放Cu离子。并与H3BTC进行了毒力比较。发现Cu离子相对A. vinelandii的抑菌效果并不强。因此，MOF-199的毒性只能部分归因于Cu离子，颗粒物本身也具有生长抑制作用。
图5 MOF-199对A. vinelandii的毒理机制
综上，我们也提出了MOF-199对A. vinelandii的影响途径。MOF-199在培养基中释放Cu离子，进入细胞质。引起氧化胁迫、ATP酶抑制以及nifH基因下调，从而导致A. vinelandii固氮酶的失活和固氮的抑制。
图6 MOF-199对A. vinelandii的影响途径
结 论
综上所述，研究了MOF材料对固氮菌的环境毒性和影响，其中MOF-199可以抑制固氮菌生长，并通过Cu离子和颗粒共同激发氧化应激介导A. vinelandii毒性。我们结果表明MOF材料对固氮菌的潜在威胁，并将有助于正在进行的MOF材料的环境风险评估。
总 结
本研究思路经典，研究内容丰富，通过多种生理指标的检测确定毒性作用和生理影响，结合转录组和生化实验数据识别关键影响节点，构建MOF对固氮菌的影响途径。其他环境毒性研究也可以借鉴其“生理指标-功能影响-构建通路”的研究思路，通过多种试验方法互相验证，更全面丰富可靠的解析生物学问题。
永利集团3044在原核转录组等转录调控方向具有丰富的项目经验，可以提供全面的测序分析服务。同时，我们的“冬季预付款”也在火热进行中，送课程！送礼品！享大额增值！菲沙给各位一个诚意满满的冬季。
参考文献：
Ouyang B, Liu F, Liang C, et al. Toxicity and activity inhibition of metal-organic framework MOF-199 to nitrogen-fixing bacterium Azotobacter vinelandii [published online ahead of print, 2021 Nov 25]. Sci Total Environ. 2021;151912.
微信公众号
027-87224696
|
marketing@frasergen.com
|
