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近日，山西大同大学医学院脑科学研究所马存根教授和闫玉清教授团队，在《Scientific reports》发表题为“Transcriptome analysis of fasudil  treatment in the APPswe/PSEN1dE9 transgenic (APP/PS1) mice model of Alzheimer’s disease”的研究论文。研究通过全转录组测序，利用APPswe/PSEN1dE9小鼠（APP/PS1，AD模型），解析了AD小鼠可能的发病机制及法舒地尔（ADF）对AD小鼠的影响。研究通过构建了ceRNA网络并发现了AD的潜在生物标志物和法舒地尔治疗的靶点，这些研究为后续AD和法舒地尔治疗提供了帮助。永利集团3044参与了本研究的测序和部分数据分析工作。

图1.文章信息

图2.技术路线

1.法舒地尔治疗改变了AD小鼠海马体中Aβ和p-Tau的表达

Aβ和p-Tau是阿尔兹海默病的生物学标志，通过免疫荧光评估了WT、ADNS和ADF小鼠海马组织中Aβ和p-Tau的表达。结果表明，AD模型小鼠种Aβ和p-Tau表达显著升高，法舒地尔可以显著降低Aβ负荷及减少AD中p-Tau的表达。

图3.法舒地尔治疗减少了海马组织中Aβ和磷酸化Tau的表达

2.法舒地尔处理的AD小鼠海马组织的全转录组分析

使用了WT、ADF和ADNS（n=3）的海马组织样本进行了全转录组测序及分析。

每个库平均获得17G的clean data，鉴定出了65,151个mRNA，其中包括57,726个已知转录本和7,425个新转录本。其中WT和ADNS之间存在403个差异表达的mRNA（DEM），192个下调和211个上调；ADNS和ADF存在626个DEM，304个下调和322个上调。通过富集分析发现，WT-ADNS之间的DEMs富集在细胞生长和死亡通；ADNS-ADF之间的DEM在神经系统通路中富集。

鉴定到了14,906个lncRNA，包括4311个已知lncRNA和10,595个新lncRNA，46个lncRNA在WT和ADNS之间差异，24个下调和22个上调；68个lncRNA在ADNS和ADF之间差异，39个下调个29个上调。通过富集分析发现，WT-ADNS差异表达的lncRNA与mRNA共表达基因集中在P13K-Akt信号通路、MAPK信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控和Rap1信号通路。在ADNS-ADF中，大多数基因涉及吞噬小体、突触小泡周期等信号通路。

图4.mRNA和lncRNA转录组分析

通过差异分析发现ADNS与WT存在13个显著差异miRNA，其中5个上调，8个下调。与ANDS相比，ADF中有16个显著差异miRNA，9个上调、7个下调。

差异分析表明，ADNS和WT存在34个显著差异circRNA，其中17个上调，17个下调。与ANDS相比，ADF中有62个显著差异circRNA，其中27个上调、35个下调。富集分析发现，WT和ADNS的circRNA差异表达与信号转导有关，包括VEGF通路、MAPK通路等。ADNS和ADF之间的circRNA差异表达也与信号转导等通路相关。

图5.miRNA和circRNA转录组分析

3.ceRNA网络的构建

构建所有mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA的ceRNA关联网络，确定了前300个ceRNA网络。还分析了差异mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA的差异表达的ceRNA网络。结果表明，9个lncRNA、14个mRNA和3个circRNA之间存在由7个miRNA介导的ceRNA网络。

图6.ceRNA网络

4.RT-PCR验证

为了验证ANDS、WT和ADF三组中RNA丰度的差异变化，我们从构建的网络中选择了1一个circRNA（mmu-circ-0005875）、2个lncRNA（lnc-009699和lnc-007479）、2个miRNA（mmu-mir-200c-3p和mmu-mir-183-5p）和4个mRNA（HINPP、Btg1、WNT4和Acsl4）进行PCR验证，结果与高通量测序结果相似，说明了测序结果的可靠性。与ADNS相比，ADF中circ0005875和HINPP均显著高于ADNS。与WT相比，WNT4在ADNS中降低，而ADF则相反。Acsl4在ADNS中表达较高，而在ADF中显著降低。与WT相比，ADNS组mmu-mir-200C-3p显著下降，ADF组可减缓或消除这种情况，对于lnc-009699也观察到了类似的变化。这些数据与测序的结果高度一致，并暗示了RNA在AD发生和法舒地尔治疗中所起到的调节作用。进一步研究lnc-007479和mmu-mir-183-5p对Btg1基因表达的调控作用。相对于WT，ADNS中Btg1存在升高的趋势，但ADF患者的Btg1显著降低，lnc-007479则相反，揭示lnc-007479与mmu-mir-183-5p呈负相关，与Btg1呈正相关。

图7.各组小鼠海马组织差异表达RNA的验证

综上所述，研究通过分析mRNAs、miRNAs、circRNAs和lncRNAs发现了AD发生的候选调控因子，还通过整合mRNA-miRNA和lncRNA-miRNA的关系构建了ceRNA网络。此外，研究还鉴定了几个潜在的调控基因Acsl4、Btg1、HINPP和Wnt4，这四个基因可能是AD的潜在生物标志物和法舒地尔治疗的靶点。

单一的mRNA或ncRNA研究已经无法满足科研的需求，生物的调控机制也需要整合多种RNA进行分析，从而探索潜在的调控网络机制，而全转录组无疑是阐释生物学问题的利器。从mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA的鉴定及分析，到ceRNA网络的构建，在全转录层面揭示转录调控机制。