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近日，河南大学尚富德教授团队以题为“Comparative methylomics and chromatin accessibilityanalysis in Osmanthus fragrans uncovers regulation of genictranscription and mechanisms of key floral scent production”的研究论文在Horticulture Research上线发表。该研究采用WGBS+ATAC-seq+ChIP-seq+RNA-seq多组学技术，分析了桂花品种"早黄"和"橙红丹桂"的花瓣组织的全基因组DNA甲基化状态、染色质可及性和基因表达信息，发现两种桂花中芳樟醇和紫罗兰酮含量不同，并且合成这两种芳香成分的相关基因（TPS2，CCD4和CCD1）的表达与甲基化水平和染色质开放性相关。ChIP-seq分析和一系列实验表明两种桂花中CCD4和CCD1的差异表达可能主要是受ERF2等转录因子调控。“橙红丹桂”中CCD4启动子区的一个183bp缺失可能是该基因在“橙红丹桂”花瓣中低表达的主要原因。本研究为桂花关键香味成分的改良选育提供了重要的理论依据。永利集团3044参与了该研究的WGBS、ATAC-seq和RNA-seq相关工作。

研究材料：桂花花瓣

测序技术：WGBS，ATAC-seq，RNA-seq，ChIP-seq

1.桂花的气相色谱-质谱（GC-MS）分析

常见的桂花品种有银桂品种群（Osmanthus fragrans Albus）、金桂品种群（Osmanthus fragrans Luteus）、丹桂品种群（Osmanthus fragrans Aurantiacus）和四季桂品种群（Asiatic group），它们所散发的桂花香气各有千秋。该研究首先对这四种桂花属12个品种的花瓣样本进行GC-MS分析。结果显示花瓣精油的主要成分为单萜芳香族成分紫罗兰酮和芳樟醇及其氧化物。“橙红丹桂”(D)花瓣中芳樟醇及其氧化物的含量最高，α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮的含量最低。而银桂“早黄”(Y)中芳樟醇及其氧化物的含量最低，β-紫罗兰酮和α-紫罗兰酮的含量却最高。因而后续主要以这两种展开实验，探究花瓣中两种主要芳香成分的产生和调控机制。

2.“早黄”和“橙红丹桂”桂花的DNA甲基化差异和染色质可及性差异

对“早黄”和“橙红丹桂”的花瓣进行WGBS实验，发现两者的CG和CHG甲基化水平差异不显著，但“橙红丹桂”基因组CHH甲基化水平显著高于“早黄”，并且两者的差异甲基化区域（DMR）在23条染色体上的分布具有显著不同。相较于“橙红丹桂”，“早黄”中有13372个高DMR和10491个低DMR。其中高DMR中51.25% CG位点、34.99% CHG位点和36.95% CHH位点在基因启动子区域3kb内，低DMR中52.42% CG位点、35.36% CHG位点和41.83% CHH位点在基因启动子区域3kb内。因此启动子的甲基化在桂花基因表达调控中起重要作用。考虑到“橙红丹桂”基因组启动子区CHH位点的甲基化率远高于“早黄”，以及CHH甲基化与RNA指导的DNA甲基化（RdDM）有关，所以更多的基因可能经历转录后沉默，基因表达可能更容易受到转录后沉默的调控。

图1 “早黄”和“橙红丹桂”花瓣的DNA甲基化差异

随后对“早黄”和“橙红丹桂”花瓣进行ATAC-seq实验分析，结果显示“早黄”和“橙红丹桂”都在转录起始位点（TSS）富集，“橙红丹桂”和“早黄”中的peak数量平均分别达到130067和130096个，分别有6106和6080个开放性增加的差异开放性区域（DAR）。DAR主要分布在远端基因间区和启动子区。“早黄”基因组中的启动子区域比“橙红丹桂”基因组中的启动子区域更加开放，并且“早黄”花瓣的基因表达上调幅度更大。

图2 “早黄”和“橙红丹桂”花瓣的染色质开放性差异

3.“橙红丹桂”桂花中芳樟醇代谢途径相关基因的表达和调控

TPS1和TPS2基因可以催化底物GPP(香叶醇焦磷酸盐)合成S-芳樟醇。该研究明确了TPS1和TPS2基因上游3kb区域的甲基化发生率在“早黄”中高于“橙红丹桂”，尤其是TPS2基因启动子区，这可能抑制TPS1和TPS2在“早黄”花瓣中的表达。另外，TPS2基因启动子区域的染色质开放性在“橙红丹桂”更高，这种增加的染色质可及性更有利于转录因子的结合，从而促进基因表达。

图3 甲基化水平和染色质开放性对“橙红丹桂”桂花中芳樟醇代谢途径相关基因表达的影响

TPS2是芳樟醇合成的关键基因。在“橙红丹桂”和“早黄”桂花的RNA-seq和qRT-PCR分析中，TPS2在“橙红丹桂”表达远高于代谢途径中的其它基因，并且在“早黄”花瓣中几乎不表达。“橙红丹桂”中TPS2基因起始密码子上游约1500bp处存在一个开放区，而在“早黄”中则处于关闭状态。序列分析显示该区域存在多个bHLH转录因子结合元件。“橙红丹桂”桂花中上调的转录因子中表达最高的是bHLH35基因，OfbHLH35和TPS2在“橙红丹桂”中不同培育时间点的表达模式相似。双荧光素酶报告基因（Dual-LUC）分析和凝胶迁移实验（EMSA）结果显示，bHLH35转录因子可能直接与TPS2启动子上游的G-box元件结合，从而正向调节TPS2的表达。此外，还有bHLH、AP2/ERF和TCP等转录因子也可能参与调控“橙红丹桂”中TPS2基因的表达，从而调节芳樟醇和芳樟醇氧化物的产生。

图4 TPS2基因的表达的和转录调控

4.桂花中紫罗兰酮产生关键基因的表达调控与转录因子ERF2有关

CCD1和CCD4基因对于桂花类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素被裂解产生β-紫罗兰酮非常重要。一方面，CCD1和CCD4在“早黄”中高表达，使得“早黄”花瓣精油中含有较多的紫罗兰酮，花色较浅且呈淡黄色。另一方面，CCD1和CCD4在“橙红丹桂”中表达较低，积累了大量的类胡萝卜素，使得“橙红丹桂”花瓣精油含有较少的紫罗兰酮，花朵为橙红色。

ATAC-seq显示CCD4基因启动子有多个染色质可及区，并且这些区域含有多个AP2/ERF转录因子结合位点。RNA-seq显示OfERF2下调，序列比对分析发现ERF2与Olea europaea ERF2、N. tabacum ERF2、Artemisia annua ERF6、Diospyros kaki ERF17和Actinidia deliciosa ERF12的氨基酸序列高度一致。系统进化树显示OfERF2与OeERF2、DkERF17、AaERF1和AaERF2具有高度相似性，由此推测OfERF2可能参与次生代谢的调节，包括萜类化合物代谢。此外，桂花基因组和观赏性状的GWAS分析结果表明ERF2基因与花的颜色有关，两种桂花中ERF2的表达模式与CCD4和CCD1一致。因此，OfERF2转录因子可能参与调控CCD4和CCD1基因的表达。

对两种桂花的ERF2进行ChIP-seq分析，发现ERF2可以与ZEP、NCED1、CCD1和CCD4基因的启动子结合。CCD1基因上游151bp处存在GCC元件，CCD4上游176bp和436bp处分别存在RAV1AAT和GCC-box元件，它们是AP2/ERF转录因子的结合位点，表明ERF2通过结合RAV1AAT和GCC-box元件来调节CCD4的表达，以及通过结合GCC-box来调节CCD1的表达，并使用烟草瞬时转化试验、qRT-PCR、双荧光素酶报告基因和EMSA实验进行了验证。

图5 ERF2 ChIP-seq peak在类胡萝卜素代谢途径中上调基因的分布

相对于“早黄”桂花，该研究在“橙红丹桂”中的CCD4基因起始密码子上游315bp处发现有一段183bp的缺失，该缺失序列与ERF2转录因子结合区重合，缺失序列中存在一个ERF2转录因子结合位点(GCC-box)。因此，“橙红丹桂”花瓣中CCD4的低表达可能主要是由于启动子区缺失了这一功能元件，阻止了ERF2转录因子与之结合，从而影响了CCD4基因的表达。

该研究应用WGBS、ATAC-seq、ChIP-seq和RNA-seq等方法分析了银桂“早黄”和“橙红丹桂”的花瓣中β-紫罗兰酮、芳樟醇及其氧化物生成的调控机制，丰富了桂花分子生物学的基础理论知识，并为桂花主要花香味成分的开发和选育提供了理论依据。