澳门·永利集团(3044-VIP认证)网站-Best Platform

Q1

HiFi进行甲基化检测的原理是什么？

PacBio平台测序有4种荧光标记，分别标记4种dNTP，其聚合酶锚定在测序芯片的底部；当DNA链与酶结合时，进行测序，测序时，荧光dNTP与酶、DNA模板形成复合物，会短暂的结合，这个过程中，当聚合酶遇到模板上甲基化的A、C等碱基时，聚合的速度就会明显变慢，并且对应的光谱特征会发生改变，这使得可以直接测A的甲基化、C的甲基化、C的羟甲基化等，具体见下图。

Q2

为什么说5mC检测是HiFi近期的重大更新？

在2020年以前，PacBio甲基化检测的重点主要集中在6mA和4mC上（所需的测序深度较高），所发的文章和项目也大多是微生物或小基因组。而在真核生物中，5mC是最常见的甲基化修饰，其中哺乳动物多发生在CpG二核苷酸序列上，植物甲基化5mC类型有CpG、CHG、CHH。

2021年2月份，PNAS上报道了一篇基于聚合酶信号特征的新算法，在人鼠中CpG位点的5mC检测准确率和敏感度皆在90%以上。而此次PacBio更新的SMRT Link 11.0，能实现CpG类型的5mC直接测序，这必然可以促进动植物甲基化的研究，也会更好地有助于理解动植物的转录调控。

Q3

如何从HiFi测序数据中获得5mC甲基化信息？

从HiFi数据中获得5mC甲基化信息，分为两种情况，一种是之前测过的HiFi数据，另一种是准备测的HiFi数据。

（1）已测过的HiFi数据

对于之前测过的HiFi数据，我们找到当时的subreads的bam文件，然后利用Primrose软件进行5mC甲基化分析，具体流程为subreads.bam--all kinetics.ccs.bam--5mc.ccs.bam。subreads.bam转all kinetics.ccs.bam命令（在Subreads的bam文件中，每条序列都记录着每个碱基的相邻碱基时滞(Inter Pulse Duration, IPD, ip tag)和峰宽(Pulse Width，pw tag)的信息。

通过上述命令转换后，kinetics.ccs.bam文件中每条ccs序列都会带上该序列正链(forward)和反链(reverse)的ip (fi，ri)和pw (fp,rp)标签）

all kinetics.ccs.bam转5mc.ccs.bam命令。直接运行primrose，输入文件为kinetics.ccs.bam，生成5mc.ccs.bam。这一结果会去除4个kinetics标签，生成2个碱基修饰相关标签（Mm和Ml）。

（2）准备测的HiFi数据

新样本准备测HiFi时，只需SMRT Link Run Design 中选择 5mC 检测，Sequel II 和Sequel IIe 系统将会在 .bam 文件中自动输出带有标签的 HiFi 数据，这些标签包括 CpG 位点 5mC 甲基化的位置和概率信息（文件大小仅比之前增加5%）。

Q4

HiFi检测的5mC甲基化结果文件怎么解读？

在primrose分析后的5mc.ccs.bam文件中，一条序列里面红色的C，代表对应碱基有5mC甲基化修饰，它的Mm用samtools view的话，显示为：Mm:Z:C+m,4,3,5,0,6

两个分号中Z代表该tag的数据类型是字符串，其中C+m，代表在‘+’链上存在C碱基的甲基化(m)，其数字解读方式为，在所有C碱基中，跳过4个未修饰，为第一个修饰碱基，再跳过3个，为第二个修饰碱基，再跳过5个....以此类推。

Ml标签则对应Mm中修饰碱基个数的8位整形数组，其值在0-255间，表示对应碱基存在修饰的概率。若值为n，则对应碱基存在修饰的概率在 n/256到(n+1)/256之间。

Q5

获得5mC文件后，如何进行后续分析？

HiFi测序，primrose分析后的bam文件，代表的是全基因组序列的甲基化信息。在此基础上，我们需要先与参考基因组进行比对（使用minimap软件），获得比对后的Aligned bam文件后，再利用pb-CpG-tools软件去获得基因组上某个位置发生甲基化的概率信息。

最后，针对单个样本，我们可以绘制基因组圈图，来展示不同位置的甲基化程度；针对多样本，我们可以进行差异甲基化的比较、也可进行甲基化与其它组学的关联分析。

Q6

HiFi检测5mC需要多少×的测序深度？

根据PacBio官方测试结果，当HiFi数据在10×以上时，基于HiFi数据检测的甲基化结果与WGBS结果就有良好的一致性，且随着测序深度的增加，相关性系数逐渐趋于平缓。因此，HiFi检测5mC，10-15×的测序深度即可。

Q7

HiFi检测5mC的灵敏性和准确性怎么样？

以人类样本为测试数据，比较了EMSeq、WGBS、ONT、HiFi等检测5mC的一致性，结果表明HiFi检测结果与其它检测结果的相关系数超过90%，这证实了HiFi检测5mC的灵敏性与准确性。

Q8

相比于其它检测技术，HiFi检测5mC的优势有哪些？

现有的甲基化检测技术，要么读长太短，要么测序准确率不够，并且很难区分单体型的甲基化信息。而HiFi检测5mC，在继承上述检测技术的优势时，还可以做到区分单体型的甲基化信息，使得在单倍型水平分析甲基化差异成为可能。

Q9

HiFi检测5mC甲基化可以有哪些应用？

如上所述，HiFi检测5mC甲基化数据深度要求低、覆盖度广、可以进行甲基化phasing，这就使得我们可以测一次HiFi数据，既可以完成基因组组装、还可以进行变异检测与甲基化分析，这可以为物种的深度解析提供全面辅助。此外，基于甲基化phasing结果，我们可以挖掘等位基因的差异甲基化、追寻亲本印记、寻找印记基因，这将有助于研究学者在更高的维度上去解析物种发育发育、疾病起因、重要表型的遗传学机制等。

Q10

HiFi检测5mC甲基化的不足点有哪些？

虽然相比于其它检测5mC甲基化的技术，HiFi有很多优势，但与之配套的生信分析软件还处于原型中，所以目前HiFi检测5mC甲基化还存在以下不足点：

• 数据的有效利用率只有50%。从HiFi序列的kinetics标签可以发现，实际上每条ccs，都会同时记录正向和反向序列的ip和pw。所以理论上，是完全可以对DNA的两条链，分别产生C+m和C-m类型的Mm tag，而目前软件的输出只有正向序列的信息。

• 对于算法准确性的描述比较模糊。PacBio Github页面只给出了非常概括性的统计量，但并没有描述MI值多高会被记为阳性，具体的过滤标准如何。